Un metodo per definire gli effetti dell'arricchimento ambientale sul Colon Microbiome biodiversità in un modello di tumore del Colon del topo
Summary
Arricchimento ambientale (EE) è un ambiente di stabulazione degli animali che viene utilizzato per rivelare i meccanismi che sottendono le connessioni tra stile di vita, lo stress e la malattia. Questo protocollo descrive una procedura che utilizza un modello murino di tumorigenesis dei due punti ed EE per definire specificamente alterazioni nel microbiota biodiversità che potrebbero influenzare la mortalità degli animali.
Abstract
Parecchi studi recenti hanno illustrato gli effetti benefici di vivere in un ambiente arricchito sul miglioramento della malattia umana. Nei topi, arricchimento ambientale (EE) riduce la tumorigenesi attivando il sistema immunitario del mouse, o colpisce sopravvivenza animale di cuscinetto del tumore stimolando la risposta di riparazione della ferita, incluso migliorata microbiome diversità, nel microambiente tumorale. Fornito qui è una procedura dettagliata per valutare gli effetti dell’arricchimento ambientale sulla biodiversità del microbioma in un modello di tumore del colon del topo. Precauzioni relative all’allevamento di animali e considerazioni per l’integrazione Colonia animale genotipo e mouse sono descritti, che infine colpiscono la biodiversità microbica. Ascoltando queste precauzioni può consentire più uniforme microbiome trasmissione e di conseguenza allevierà non-trattamento effetti dipendenti che possono confondere i risultati dello studio. Inoltre, in questa procedura, microbiota modifiche sono caratterizzate tramite sequenziamento del 16S rDNA del DNA isolato dalle feci raccolti dal colon distale dopo arricchimento ambientale a lungo termine. Lo squilibrio del microbiota intestinale è associato con la patogenesi di infiammatorie intestinali malattia e cancro del colon, ma anche di obesità e diabete tra gli altri. D’importanza, questo protocollo per l’analisi EE e microbiome può essere utilizzato per studiare il ruolo della patogenesi microbiome attraverso una varietà di malattie dove esistono modelli murini robusto che può ricapitolare la malattia umana.
Introduction
Studi di arricchimento ambientale (EE) utilizzano parametri complessi alloggiamento per interessare la stimolazione sociale (gabbie di custodia di grandi dimensioni, grandi gruppi di animali), stimolazione cognitiva (capanne, tunnel, materiali di nidificazione, piattaforme) e attività fisica (in esecuzione ruote). EE è stato utilizzato da molti laboratori per capire gli effetti di una maggiore attività e interazioni sociali e cognitive migliorate sulla malattia iniziazione e progressione utilizzando una vasta gamma di modelli murini, inclusi barbering alopecia indotta, morbo di Alzheimer, La sindrome di Rett e la malattia del tumore e digestivo diversi modelli1,2,3,4,5,6.
Sono stati sviluppati diversi modelli di mouse per studiare il tumorigenesis dei due punti in topi. Forse il modello più ben definito è il mouse ApcMin . Il mouse di ApcMin è stato sviluppato nel laboratorio di William colomba nel 19907e viene utilizzato come un modello murino di mutazioni del gene APC che sono comunemente associati con cancro colorettale umano. In contrasto con gli esseri umani che harboring le mutazioni di APC , ApcMin topi sviluppano principalmente piccoli tumori intestinali, con un avvenimento molto raro di tumori del colon. Tuttavia, un allele Tcf4Het con una singola mutazione eterozigotica Knockin ‘ knock-out in Tcf4, aumenta considerevolmente il tumorigenesis dei due punti quando combinato con l’ allele di ApcMin 8. Recentemente, questo modello del topo di tumorigenesis dei due punti è stato utilizzato per determinare gli effetti di EE il colon tumorigenesi6. Nella Bice et al. lo studio, gli effetti fisiologici e fenotipici dell’EE su maschi e femmine di quattro linee di diverso tipo di mouse (wild type (WT), Tcf4Het / + Apc+ +, Tcf4+ + ApcMin / +, e Tcf4 Het / + APCMin / +)) sono stati definiti. Forse la scoperta più interessante era che EE aumenta significativamente la durata della vita degli animali del colon del tumore-cuscinetto sia maschile che femminile. Questo ha dimostrato che EE può ridurre almeno alcuni dei sintomi associati con tumorigenesis dei due punti e migliorare la salute degli animali. Notevolmente, questa durata migliorata nei maschi non è un risultato diretto della ridotta tumorigenesi e invece era legata all’avvio di una risposta, incluso il miglioramento microbiome biodiversità6di cicatrizzazione del tumore.
Sono stati pubblicati diversi studi specifici di EE con risultati interessanti. Tuttavia, dal punto di vista tecnico, importanti risultati spesso non sono traducibili in altri laboratori. Il mantenimento di metodologie EE identici tra laboratori diversi è un problema incredibilmente complesso, non solo a causa di dispositivi di arricchimento e alloggio utilizzato, ma anche biancheria da letto, cibo, ventilazione, allevamento, genetica, attività in camera e protocollo animale requisiti, tra gli altri9,10,11. Un esempio è integrazione animale, dove gli animali devono essere stabilmente integrati nella Colonia del mouse, quindi normalizzare la composizione genetica di sfondo e la dieta, per evitare gli effetti correlati non-trattamento. Ulteriormente, molti studi EE sono stati completati prima della realizzazione dell’importanza del microbioma nella malattia e il modo che comuni pratiche di allevamento del mouse possono influenzare la composizione del microbioma intestinale10,12.
Posizionamento di strategia e animale di allevamento in EE può aumentare lo sforzo, se non effettuata correttamente. Poiché gli studi EE utilizzano un numero elevato di animali maschii e femminili e di genotipi multipli, messa a punto sperimentale può essere difficile dato il requisito per gli animali da cucciolate diverse da combinare. Di conseguenza, un allevamento e lo svezzamento di strategia è stato sviluppato per consentire la combinazione di animali svezzati del genotipo corretto da diverse cucciolate. La motivazione principale per questo era a normalizzare il microbiota tra cucciolate e a ridurre lo stress quando gli animali sono stati spostati all’ambiente sperimentale. Il microbioma è stata trasmessa dalla diga10. Per garantire la diversità microbica alla Colonia, le femmine erano acquistate da Jackson Labs e integrate nella Colonia per un mese prima che l’esperimento ha cominciato9,10,12. Per normalizzare ulteriormente microbiome biodiversità tra gli animali, le femmine erano co-ospitate prima dell’allevamento. A seguito allevamento, alloggio comunale durante l’allevamento e la possibilità di fuggire cura cuccioli migliorato i livelli di stress di cure materne13,14, possibilmente promuovendo microbiome normalizzazione. Per evitare la non-EE correlati effetti sul microbioma, questa custodia comune di tutti gli animali sperimentali ha impedito lo stress di combattimento e altre che si sono verificati quando si combinano diversi maschi da cucciolate diverse in una gabbia sperimentale. Infine, un numero uguale di animali di tutti i genotipi sono stati inclusi nelle gabbie. Questo ha offerto l’opportunità per la biodiversità microbiota migliorata attraverso genotipi e rimosso il contributo di coprofagia (tendenza dell’animale a consumare sgabello) o possibili differenze di comportamento di genotipo specifico allo studio generale.
Questo protocollo fornisce una strategia che si espande gli studi per includere aspetti noti del microbioma ricerca, compresa l’integrazione di microbiota animale e trasmissione Colonia per la normalizzazione del microbiota, per consentire più uniforme microbiome popolazioni precedenti-EE tra gli animali da esperimento. Ascoltando queste precauzioni è essenziale a causa della capacità di non-trattamento correlate microbiota differenze per confondere i risultati dello studio. Eliminando non-EE relative modifiche microbiota permetterà ai ricercatori di definire specificamente il ruolo di EE sulla composizione del microbiota durante lo sviluppo della malattia e la progressione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questa procedura permette l’analisi del microbiota isolato dalle feci dopo arricchimento ambientale di normale o animali del cuscinetto del tumore. Perché questi sono grandi esperimenti che coinvolgono allevamento per ottenere molti animali di sesso diverso e genotipi, normalizzando il microbioma tra animali prima dell’inizio dell’esperimento è essenziale per evitare la non-EE correlati effetti sul microbioma biodiversità.
Per coerenza tra condizioni NE ed EE, il processo di allevamento vie…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo B. Dalley nel nucleo della University of Utah genomica per sequenza di biblioteca e K. Boucher nel nucleo della University of Utah Biostatistica per consulenza statistica e l’accesso a questi tecnici core supportati dal premio del National Cancer Institute P30 CA042014. Il progetto descritto è stato sostenuto dal National Cancer Institute sovvenzioni P01 CA073992 e K01 CA128891 e la Huntsman Cancer Foundation.
Materials
| Teklad Diets/Harlan Labs Chow | Harlan Labs | 3980X | Standard irradiated chow formulated by Dr. Mario Capecchi in collaboration with Harlan Labs. |
| Cell-Sorb Plus bedding | Fangman Specialties | 82010 | Autoclave prior to use. |
| AIMS Tattooing System For Neonates | AIMS | NEO-9 | https://animalid.com/neonate-rodent-tattoo-identification/32. Other animal grade tattoo systems and inks can be used with similar results including the Aramis Micro Tattoo Kit. |
| Zyfone One Cage 2100 AllerZone Mouse Micro-Isolator System Complete with cage, AllerZone filter top and modular diet delivery system | Lab Products | 82120ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Zyfone One Cage 2100 Life Span Enrichment Device | Lab Products | 82109ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Zyfone One Cage 2100 Cage 13-7/8" Length X 19-1/16" Width X 7-3/4" Depth | Lab Products | 82100ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Zyfone One Cage 2100 AllerZone Micro-Isolator filter top | Lab Products | 82101ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Tunnel | Bio-Serv | K3323 or K3332 | Connect cages together and use for enrichment |
| Grommet to connect Tunnel to cages | Fabricated by the University of Utah Machine Shop | n/a | Be certain the material is resistant to chewing and autoclavable |
| Fast-track wheel | Bio-Serv | K3250 or K3251 | Use with mouse igloo and floor |
| Mouse Igloo | Bio-Serv | K3328, K3570 or K3327 | Use with Fast-track wheel and floor |
| Mouse Igloo floor | Bio-Serv | K3244 | Use with mouse Igloo and Fast-Track |
| Mouse Hut | Bio-Serv | K3272, K3102 or K3271 | |
| Crawl Ball | Bio-Serv | K3330 or K3329 | |
| Bio-hut | Bio-Serv | K3352 | Wood pulp hut used for sheltering and nesting |
| Adhesive film | VWR | 60941-072 | Use to temporarily cover drilled hole in large cage to prevent mice from escaping |
| Laminar Flow Ventilated Rack | Techniplast | Bio-C36 | The cabinet we used in this study is not currently supplied. The Bio-C36 is very similar. |
| 1.5 mL Microfuge Tube- RNAse and DNAse free | Any supplier | ||
| QIAamp DNA Stool MiniKit | Qiagen | 51504 | This kit supplies reagents for 50 DNA preparations. Stool Lysis Buffer=ASL; Guanidinium Chloride Lysis Buffer= AL; Wash Buffer 1 with Guanidinium Chloride= AW1; Wash Buffer 2= AW2; Elution Buffer with EDTA=AE |
| Waterbath (capable of heating to 95) | Any supplier | For 94 degree incubation of stool samples to lyse cells. | |
| Waterbath (capable of heating to 70 degrees) | Any supplier | For 70 degree incubation of stool samples | |
| Ethanol (200 proof) | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Fluorometer: Qubit | ThermoFisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit dsDNA broad Range Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| EB Buffer or 10 mM Tris pH 8.5 | Qiagen | 19086 | |
| Experiment specific primers | Any Supplier | ||
| PCR grade water | Any supplier | ||
| 2X KAPA HiFi HotStart Ready Mix | Kapa Biosystems | KK2601 | For Amplicon Amplification (1.25 mL allows 100 rxns). |
| Agarose for running diagnostic gels | Any supplier | ||
| TapeStation High Sensitivity D1000 Screen Tape Trace | Agilent | 5067-5583 | TapeStation or Bioanalyzer instruments are common in Institutional Genomics Cores to analyze library quality . Alternatively a Bioanalyzer DNA1000 Chip (Agilent, 5067-1504) can be used. |
| Agencourt AMPure XP Magnetic Beads | Beckman Coulter | A63880 | Magentic beads For PCR cleanup- 5 mL will clean 250 PCR reactions |
| Magnetic stand | Life Technologies | AM10027 | |
| Library Preparation Guide | Illumina | Illumina. 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation: Preparing 16S ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System. https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf. | |
| Unique Dual Indexing | Illumina | Illumina Experiment Manager Software | Freely available at: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/experiment_manager/downloads.html |
| Nextera XT 96 Index Kit | Illumina | FC-131-1002 | Used to add barcodes to amplicons |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate | Applied Biosystems/ThermoFisher | N8010560 | |
| TruSeq Index Plate Fixture | Illumina | FC-130-1005 | |
| Adhesive clear plate seal | Applied Biosystems /ThermoFisher | 4360954 | Applied Biosystems/ThermoFisher Microamp adhesive film |
| Sequencing by MiSeq with v3 reagents and dual 300 bp reads | Illumina | MS-102-3003 | |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3001 | |
| Proteinase K (600 mAU/ml) | Qiagen | 19131 | Equivalent to 20 mg/ml of proteinase K. Supplied with QiaAmp kit |
| Data Analysis Tools | Qiime | QIIME software Tools | Installation may differ based on your system and the QIIME website describes several options (http://qiime.org/install/install.html). For this study, MacQIIME software package 1.9.1 was utilized (compiled by Werner Lab, SUNY, http://www.wernerlab.org/software/macqiime |
| Step 13.2. | Qiime | FastQ Join method | (http://code.google.com/p/ea-utils ). For this study Multiple join paired ends was used http://qiime.org/scripts/multiple_join_paired_ends.html. Aronesty, E. ea-utils: Command-line tools for processing biological sequencing data. Expression Analysis, Durham, NC. (2011). |
| Step 13.3. | Qiime | De-Novo OTU picking protocol | http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html. |
| Step 13.3.1. | Open Taxonomic Units (OTUs) using Uclust | Edgar, R.C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461, doi:10.1093/bioinformatics/btq461 (2010). | |
| Step 13.3.1. | Pynast | Pynast | Caporaso, J.G. et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26 (2), 266-267, doi:10.1093/bioinformatics/btp636 (2010). |
| Step 13.3.1. | Pynast | Pynast_Greengenes | DeSantis, T.Z. et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Appl Environ Microbiol. 72 (7), 5069-5072, doi:10.1128/AEM.03006-05 (2006). Greengenes version 13_8 was used in this study |
| 13.3.1. Note: | Qiime | Multiple Split Libraries | http://qiime.org/scripts/multiple_split_libraries_fastq.html. |
| 13.3.1. Note: | Qiime | Pick de novo OTUs script | http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html |
| Step 13.2.2. | Qiime | Create a mapping file | http://qiime.org/documentation/file_formats.html. |
| Step 13.2.2. | Qiime | Validate a mapping file | http://qiime.org/scripts/validate_mapping_file.html. |
| Step 13.3.3. | Qiime | Link the OTU to sample description to mapping file | http://qiime.org/scripts/make_otu_network.html. |
| Step 13.3.4. | Qiime | Summarize Taxa through plots | http://qiime.org/scripts/summarize_taxa_through_plots.html. |
| Step 13.3.5. | Qiime | Biome Summarize table | http://biom-format.org/documentation/summarizing_biom_tables.html In this study, all samples were rarified to 20,000 OTUs followed by analysis using alpha rarefaction script in QIIME. |
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