Burada bir iletişim kuralı açıklamak yüksek üretilen iş RNAi tarama oncolytic virüs tedavisi geliştirmek için manipüle edilebilir ana hedefleri ortaya çıkarmak için istihdam için özellikle rhabodvirus ve vaksinia virüs tedavisi, ama -ebilmek var olmak diğer oncolytic için kolayca adapte virüs platformlar veya virüs çoğaltma genellikle modüle ana bilgisayar genler keşfetmek için.
Yüksek işlem hacmi genom çapında RNAi (RNA müdahale) tarama teknoloji virüs çoğaltma etkileyen ana faktörler keşfetmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada bu teknoloji uygulama özellikle Maraba virüs, bir oncolytic rhabdovirus ve vaksinia virüs çoğaltma terapi artırılması amacı ile modüle ortaya çıkarılması ana hedefleri için mevcut. Protokol oncolytic Maraba virüs ve oncolytic vaksinia virüs ile kullanım için test edilmiştir, bu yaklaşım diğer oncolytic virüsler için uygulanabilir ve ayrıca virüs çoğaltma memeli hücrelerinde modüle ana hedefleri belirlemek için yararlı olabilir Genel. Geliştirme ve doğrulama için yüksek üretilen iş RNAi tarama memeli hücrelerinde, kritik noktalar ve hazırlık adımları bir birincil yüksek üretilen iş RNAi ekran ve bir adım adım kılavuz için yürütmek için önemli bir testin Bu protokolünü açıklar birincil bir yüksek-den geçerek RNAi ekran yürütülmesi; Buna ek olarak, genel olarak ikincil ekran doğrulama ve Tersiyer doğrulama çalışmaları yürütmek için yöntemleri özetlenmektedir. Bir katalog, bir kapsamlı ve tarafsız biçimde, virüs çoğaltma için bir infektivite gibi bir vitro tahlil geliştirmek herhangi bir yönünü modüle ana faktörler sağlar tarama olduğu yüksek üretilen iş RNAi yararına veri bloğu boyutu, ve sitotoksisite. Güç biotherapeutic hedefleri beklenmedik geçerli bilgiye dayalı ortaya çıkarmak için vardır.
Yüksek işlem hacmi genom çapında RNAi tarama çalışmanın virüs Biyoloji de dahil olmak üzere çeşitli alanlarda biyolojik anlayışlar ifşa için paha biçilmez bir araç olarak kanıtlamıştır. Son on yıl ya da daha fazla, çok sayıda gruplar hücre tabanlı büyük ölçekli RNAi yoğun virüs çoğaltma (1,2,3,4 yorum modüle ana bilgisayar genlerin tanımlamak için eleme üstlendik , 5 , 6 , 7). İlginçtir, bu ekranlar, çok sayıda gerçekleştirdik kanser hücrelerinin ve birkaç vaksinia virüs8,9,10 da dahil olmak üzere geçerli oncolytic virüs aday olan virüs ile , Miksoma virüs11, herpes simpleks virüs12, vesicular Stomatit virüs13,14ve Maraba virüs15. Bu çalışmaların çoğu odak virüs çoğaltma bazı yönlerini etkileyen ana faktörler tanımlama ve oncolytic virüs tedavisi arttırmak için biotherapeutic hedef belirlemekle değil iken, değerli veri içinde bu veri kümelerinden mayınlı Bu konuda. Bu oncolytic virüs tedavisi geliştirmek için manipüle edilebilir ana hedefleri tanımlamak için güçlü potansiyel tam olarak istismar olmayan ki açıktır.
Oncolytic virüs platformlarına bir bolluk şu anda test ediliyor hangi gözle son aşama klinik çalışmalarda başarıya sahiptir herpes simpleks virüs, reovirus ve vaksinia virüsü, dahil olmak üzere preklinik ve klinik çalışmalar. Bu platformlar çoğunluğu için çabaları virüs genleri değiştirerek doğru tedavi geliştirmek için yönetti. Örneğin, tümör özgüllüğü artırmak için belirli virüs genleri silinmiş veya önemli ölçüde viral çoğaltma normal hücreleri ama tümör hücreleri kısıtlamak için mutasyona uğramış. Bazı durumlarda, transgenes GM-bağışıklık yanıtı artırmak için CSF (granülosit makrofaj koloni uyarıcı faktör) içinde vivo görüntüleme ve hücresel radioiodide alımı etkinleştirmek için NIS (sodyum iyodür simporter) gibi için eklenmiş olabilir veya tedavi amaçlar. Ancak, ana bilgisayar/tümör genler manipüle ve oncolytic virüs çoğaltma ana bilgisayar/tümör genler etkilerini keşfetmek odaklanmış çok az çalışma olmuştur. Yüksek üretilen iş tarama teknoloji çıkışıyla, şimdi ana bilgisayar virüs etkileşimleri bir genom ölçekte soruşturma için ve oncolytic virüs tedavisi geliştirmek için ana bilgisayar genom işlemek için fırsatlar deşifre etmek mümkündür (16‘, gözden 17,18).
Biz ilk çalışma gösteren,-yüksek-den geçerek oncolytic virüs tedavisi geliştirmek için manipüle edilebilir ana hedefleri tanımlamak için eleme genetik kullanmak için prototip bildirdi. Maraba virüs oncolysis, bir oncolytic rhabdovirus aşamasında sınanmakta modüle ana bilgisayar genler keşfetmek için ı ve II denemeler, biz genom çapında RNAi ekranlar yinelenen bir siRNA (kısa RNA müdahale) ile üç farklı tümör hücre hatları üzerinden yapılan Kütüphane 18,120 genler15hedefleme. Ekranları tespit sayısı yolu analizini zenginleştirme ER (endoplazmik retikulum) stres yanıt yolları üyelerinin saptandı. Biz 10 hits içinde bu yollar bu birincil ekranın farklı hedefleme serileri ile siRNA kullanarak ikincil doğrulama için seçildi. Tersiyer doğrulama bir parçası olarak, biz bir kurtarma IRE1α ile deney (hit hedef olduğunu onaylamak için inositol gerektiren enzim 1 alfa). Vitro ve in vivo küçük molekül inhibitörü olan IRE1α kullanarak test önemli ölçüde geliştirilmiş oncolytic etkinlik sonuçlandı.
Workenhe vd. 12 de yürütülen bir havuza alınan lentiviral shRNA (kısa saç tokası RNA) kullanarak bir genom geniş RNAi perde 1 (HSV-1) mutant KM100-aracılı oncolysis meme tür kitaplığına insan herpes simpleks virüsü kısıtlayan ana faktörleri tanımlamak için 16,056 genler hedefleme kanser hücreleri. Birincil ekranında, sahte enfekte hücreleri üzerinde gelişmiş sitotoksisite KM100 enfekte hücre için hangi yol nakavt 343 genleri tespit; 24 bu genlerin ikincil doğrulama için seçtikleri. 24 genlerin dışarı 8 genler bir tanesi ile ikincil ekranında teyit edildi daha sonra üçüncül doğrulama sırasında bir genetik kurtarma deneyi kullanarak teyit edildi (serin/arginin-zengin Uçbirleştirme faktör 2) SRSF2 olmak. Grup SRSF2 fosforilasyon azaltılmış ve HSV-1 KM100 kombinasyon tedavisi ile genişletilmiş TUBO tümörü taşıyan fareler yaşama bu inhibitörü yol gösterdi ki bir DNA topoizomeraz inhibitörü ilaçlar tanımlamak için devam etti.
Söz konusu çalışmalarda, benzer bir iş akışı izledi. Her birincil ekran tanımlanan sayısı belirli bir sayıda tarafından ikinci bir ekran izledi birincil bir genom geniş RNAi perde ile başladı. Bu hit hedef üzerinde olduğunu onaylayan dahil Tersiyer doğrulama çalışmaları tarafından izledi genetik gerçekleştirerek deneyleri içinde vitro hedef gen ürün içinde vivomanipüle ederek son doğrulaması ile kurtarma. Bu makalede, biz ilk bir genel protokol geliştirme ve en iyi transfection koşulları, virüs miktarı ve enfeksiyon uzunluğunu belirleme içerir yüksek üretilen iş siRNA-tarama testin doğrulama için sağlar. Ayrıca birincil yürütmek için detaylı bir protokol yönteminin ikinci ekran doğrulama ve Tersiyer doğrulama gerçekleştirmek için genel bir açıklama yanı sıra yüksek üretilen iş siRNA ekran sunuyoruz.
Burada yüksek üretilen iş RNAi tarama oncolytic virüs tedavisi geliştirmek için manipüle edilebilir ana hedefleri tanımlamak için istihdam için bir iletişim kuralı mevcut. Bu başarıyla oncolytic Maraba virüs ve oncolytic vaksinia virüs ile test edilmiştir ama belirtildiği gibi bu diğer oncolytic virüsler veya diğer virüsler ile kullanmak için genellikle virüs çoğaltma modüle ana bilgisayar genlerin tanımlamak için adapte edilebilir. Tarama protokolü de yayılmasını azaltabilir veya artıra…
The authors have nothing to disclose.
Bu eser tarafından hibe Ontario Enstitüsü’nden kanser araştırmaları, Kanada Vakfı için yenilik, Ottawa bölgesel kanser Vakfı ve Terry Fox Araştırma Enstitüsü için desteklenmiştir. K.J.A. Vanier Kanada yüksek lisans burs, Sağlık Araştırma-Master’s Ödülü, Kanada Enstitüsü tarafından desteklenen ve bir Ontario yüksek lisans burs.
Consumables | |||
siRNA library | GE Dharmacon | G-005005-02 | |
Corning 384-well plate | Corning | 3985 | |
Falcon 384-well plate | Becton Dickinson | 353962 | |
Water | Sigma | W4502 | |
siGenome SMARTpool PLK1 | GE Dharmacon | M-003290-01 | |
AllStars Negative Control siRNA | Qiagen | SI03650318 | |
siGenome Non-targeting siRNA Pool #2 | GE Dharmacon | D-001206-14-20 | |
DMEM/HIGH Glucose | GE Healthcare Life Sciences | SH30022.01 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma | F15051-500ML | |
HEPES solution (1M) | Sigma | H3535-100ML | |
Penicillin-Streptomycin 100X solution | GE Healthcare Life Sciences | SV30010 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 2500056 | |
DPBS/Modified | GE Healthcare Life Sciences | SH30028.02 | |
Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778100 | |
Oligofectamine | Thermo Fisher Scientific | 1225011 | |
Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 22600-050 | |
Resazurin sodium salt | Sigma | R7017-5G | |
Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H21492 | |
Formaldehyde (37% by weight) | Fisher Scientific | F79-4 | |
500 ml bottles | Corning | 430282 | |
Adhesive Sealing Film For Microplates | Excel Scientific | 361006007 | |
Peelable Heat Sealing Foil | Thermo Fisher Scientific | AB-3720 | |
BioTek MicroFlo Select Dispenser cassette | Fisher Scientific | 11-120-625 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
MicroFlo Select (liquid dispenser) | Fisher Scientific | 11120621 | |
BioTek Synergy HT plate reader | Biotek | N/A | |
Opera Imaging and Analysis Instrument | PerkinElmer | HH10000115 | |
KiNEDx Robotic Arm | Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) | KX-300-660 | |
Cytomat 24C Series Automated Incubator | Thermo Fisher Scientific | 50080227 | |
JANUS Automated Workstation | PerkinElmer | AJI4M01 | |
Plate Carousel | Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) | N/A | |
Alps 3000 plate sealer | Thermo Fisher Scientific | AB-3000 |