Aqui descrevemos um protocolo para empregar o rastreio com throughput alto RNAi para descobrir destinos de host que podem ser manipulados para aumentar a terapia de vírus Oncolíticos, especificamente a terapia rhabodvirus e vaccinia vírus, mas pode ser facilmente adaptado para outros Oncolíticos plataformas de vírus ou para descobrir genes de anfitrião que modulam a replicação do vírus em geral.
Tecnologia de rastreio do elevado-throughput todo o genoma RNAi (RNA de interferência) foi amplamente utilizada para descobrir os fatores do hospedeiro que afetam a replicação do vírus. Aqui apresentamos a aplicação desta tecnologia para descobrir destinos de host que modulam especificamente a replicação do vírus de Marabá, um Rhabdovírus Oncolíticos e vírus vaccinia, com o objetivo de reforçar a terapia. Enquanto o protocolo foi testado para uso com Oncolíticos Marabá vírus e vírus do vaccinia Oncolíticos, esta abordagem é aplicável a outros vírus Oncolíticos e também pode ser utilizada para identificar alvos de anfitrião que modulam a replicação do vírus em células de mamíferos em geral. Este protocolo descreve o desenvolvimento e validação de um ensaio para a seleção de RNAi da elevado-produção em células de mamíferos, as considerações-chave e as etapas de preparação importantes para a realização de uma tela de RNAi alta produtividade primária e um guia passo a passo para realização de uma tela de RNAi alta produtividade primária; Além disso, ele amplamente descreve os métodos para a realização de estudos terciários de validação e validação de ecrã secundário. O benefício do elevado-throughput RNAi triagem é que permite que um de catalogar, de forma ampla e imparcial, fatores do hospedeiro que modulam a qualquer aspecto da replicação do vírus para o qual se pode desenvolver um ensaio em vitro como infectividade, estourou o tamanho, e citotoxicidade. Tem o poder para descobrir bioterapêutico metas imprevistas, com base no conhecimento atual.
Rastreio com throughput alto todo o genoma RNAi tem provado para ser uma ferramenta inestimável para revelando insights biológicas em diversas áreas de estudo, incluindo biologia de vírus. Ao longo da última década ou assim, numerosos grupos comprometeram-se baseada em célula em grande escala RNAi triagem para extensivamente identificar genes de anfitrião que modulam a replicação do vírus (revisado em1,2,3,4 , 5 , 6 , 7). Curiosamente, um grande número dessas telas foram realizado em células cancerosas e diversas com vírus que são candidatos de vírus Oncolíticos atual incluindo vaccinia vírus8,9,10 , De vírus mixoma11, herpes simplex vírus12, estomatite vesicular vírus13,14e Marabá vírus15. Embora o foco da maioria desses estudos foi na identificação de fatores do hospedeiro que influenciam a algum aspecto da replicação do vírus e não na identificação de alvos bioterapêutico para reforçar a terapia de vírus Oncolíticos, dados valiosos poderiam ser extraídos esses conjuntos de dados em Neste contexto. É claro que o potencial poderoso para identificar alvos de host que podem ser manipulados para aumentar a terapia de vírus Oncolíticos não foi totalmente explorado.
Uma infinidade de plataformas de vírus Oncolíticos… estão a ser testadas em estudos pré-clínicos e clínicos incluindo herpes simplex vírus, reovírus e vaccinia vírus, que têm tido sucesso demonstrável em experimentações clínicas do tarde-estágio. Para a maioria destas plataformas, esforços tem sido direcionados para alterar a genoma do vírus para melhorar a terapia. Por exemplo, para aumentar a especificidade do tumor, genes de vírus específicos foram excluídos ou uma mutação para restringir significativamente a replicação viral em células normais, mas não em células tumorais. Em alguns casos, transgenes foram adicionados como GM-CSF (fator estimulante de colônia de macrófagos granulócitos) para potencializar a resposta imune ou NIS (iodeto de sódio symporter) para permitir que vivo em imagem e absorção celular radioiodide para terapêutica fins. No entanto, tem havido muito pouco trabalho focado em genes do hospedeiro/tumor a manipular e explorar o impacto dos genes do hospedeiro/tumor na replicação de vírus Oncolíticos. Com o advento da tecnologia de rastreio com throughput alto, agora é possível sondar interações hospedeiro-vírus à escala do genoma e a decifrar as oportunidades para manipular o genoma do hospedeiro para melhorar a terapia de vírus Oncolíticos (revisado em16, 17,,18).
Nós relatamos o primeiro estudo demonstrando prova de conceito para a utilização da elevado-produção genética de rastreio para identificar alvos de anfitrião que podem ser manipulados para melhorar a terapia de vírus Oncolíticos. Para descobrir genes de anfitrião que modulam Marabá vírus oncolysis, um Rhabdovírus Oncolíticos atualmente está sendo testado em fase I e ensaios II, realizamos telas de RNAi todo o genoma em três linhas de células de tumor diferente em duplicado com um siRNA (RNA de interferência curto) biblioteca de direcionamento de genes 18.12015. Caminho análise de acertos identificados nas telas revelou enriquecimento de membros das vias resposta stress ER (retículo endoplasmático). Nós selecionamos 10 sucessos dentro destes caminhos para validação secundário usando siRNA com sequências alvos diferentes da tela principal. Como parte da validação do terciária, foi realizado um experimento de resgate com IRE1α (inositol-requerendo alfa de enzima 1) para confirmar que o hit foi no alvo. In vitro e em vivo testando usando um inibidor de pequena molécula de IRE1α resultaram em eficácia Oncolíticos dramaticamente melhorada.
Workenhe et al . 12 também conduziu a uma tela de RNAi genoma-larga usando um pool particulas de Lentivirus shRNA (curto grampo do RNA) biblioteca visando 16.056 genes para identificar fatores do hospedeiro restringindo o vírus humano herpes simplex tipo 1 (HSV-1) mutante mediada por KM100 oncolysis da mama. células cancerosas. Na tela principal, eles identificaram 343 genes o nocaute de que levam ao aprimorado citotoxidade de células infectadas KM100 sobre células infectadas por simulação; Eles selecionaram 24 destes genes para validação secundária. Fora os 24 genes, 8 genes foram confirmados na tela secundária com um deles sendo SRSF2 (arginina e serina-rich splicing factor 2), que foi posteriormente confirmada usando um experimento genético de resgate durante a validação terciária. O grupo passou a identificar um DNA topoisomerase inibidor de quimioterápicos que reduziu a fosforilação de SRSF2 e mostrou que o tratamento de combinação de HSV-1 KM100 com essa pista de inibidor de sobrevivência prolongada dos ratos de tumor-rolamento do TUBO.
Nos estudos acima mencionados, seguiu-se um fluxo de trabalho semelhante. Cada um começou com uma tela de RNAi genoma-largo principal seguida por uma tela secundária em um seleto número de sucessos identificados na tela principal. Este foi seguido por estudos de validação terciária, que incluía confirmando que o acerto no alvo realizando genética resgatar experimentos in vitro com final validação executada manipulando o alvo gene produto em vivo. Neste artigo, nós primeiro fornecer um protocolo geral para o desenvolvimento e validação de um ensaio de siRNA-rastreio de alto rendimento, que envolve determinar as condições ideais de transfeccao, quantidade de vírus e comprimento de infecção. Oferecemos também um protocolo detalhado para a realização de uma primária, uma tela de siRNA de alto rendimento, bem como uma descrição geral do método para executar validação de tela secundária e terciária validação.
Aqui nós apresentamos um protocolo para empregar o rastreio com throughput alto RNAi para identificar alvos de host que podem ser manipulados para aumentar a terapia de vírus Oncolíticos. Isso foi testado com sucesso com Oncolíticos Marabá vírus e vírus do vaccinia Oncolíticos, mas, como foi observado, pode ser adaptado para uso com outros vírus Oncolíticos ou outros vírus geralmente para identificar genes de anfitrião que modulam a replicação do vírus. O protocolo de triagem também é projetado para iden…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado por subsídios do Instituto de Ontário para pesquisa do câncer, a Fundação do Canadá para a inovação, o Ottawa Regional Cancer Foundation e o Instituto de pesquisa do Terry Fox. K.J.A. foi apoiado por uma bolsa graduação Canadá Vanier, um Instituto canadense de saúde pesquisa-mestrado Award e uma bolsa de pós-graduação de Ontário.
Consumables | |||
siRNA library | GE Dharmacon | G-005005-02 | |
Corning 384-well plate | Corning | 3985 | |
Falcon 384-well plate | Becton Dickinson | 353962 | |
Water | Sigma | W4502 | |
siGenome SMARTpool PLK1 | GE Dharmacon | M-003290-01 | |
AllStars Negative Control siRNA | Qiagen | SI03650318 | |
siGenome Non-targeting siRNA Pool #2 | GE Dharmacon | D-001206-14-20 | |
DMEM/HIGH Glucose | GE Healthcare Life Sciences | SH30022.01 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma | F15051-500ML | |
HEPES solution (1M) | Sigma | H3535-100ML | |
Penicillin-Streptomycin 100X solution | GE Healthcare Life Sciences | SV30010 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 2500056 | |
DPBS/Modified | GE Healthcare Life Sciences | SH30028.02 | |
Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778100 | |
Oligofectamine | Thermo Fisher Scientific | 1225011 | |
Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 22600-050 | |
Resazurin sodium salt | Sigma | R7017-5G | |
Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H21492 | |
Formaldehyde (37% by weight) | Fisher Scientific | F79-4 | |
500 ml bottles | Corning | 430282 | |
Adhesive Sealing Film For Microplates | Excel Scientific | 361006007 | |
Peelable Heat Sealing Foil | Thermo Fisher Scientific | AB-3720 | |
BioTek MicroFlo Select Dispenser cassette | Fisher Scientific | 11-120-625 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
MicroFlo Select (liquid dispenser) | Fisher Scientific | 11120621 | |
BioTek Synergy HT plate reader | Biotek | N/A | |
Opera Imaging and Analysis Instrument | PerkinElmer | HH10000115 | |
KiNEDx Robotic Arm | Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) | KX-300-660 | |
Cytomat 24C Series Automated Incubator | Thermo Fisher Scientific | 50080227 | |
JANUS Automated Workstation | PerkinElmer | AJI4M01 | |
Plate Carousel | Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) | N/A | |
Alps 3000 plate sealer | Thermo Fisher Scientific | AB-3000 |