Здесь мы описываем протокол для применения высокопроизводительного скрининга RNAi раскрыть узел целевые объекты, которые можно манипулировать для повышения онколитического вирус терапии, специально rhabodvirus и vaccinia вируса терапия, но она может быть легко адаптированы для других онколитического вирус платформ или для обнаружения узла генов, которые модулируют репликации вируса в целом.
Высок объём генома общесистемной интерферирующих РНК (РНК-интерференции) скрининг технология широко используется для обнаружения хоста факторов, которые влияют на репликацию вируса. Здесь мы представляем применение этой технологии для раскрытия узла цели, которые конкретно модулировать репликации вируса Мараба, онколитического rhabdovirus и vaccinia вируса с целью повышения эффективности терапии. В то время как протокол был протестирован для использования с онколитического Мараба вирус и онколитического vaccinia вируса, этот подход применим к другим онколитического вирусов и также может быть использован для идентификации узла цели, которые модулируют репликацию вируса в клетках млекопитающих в Общие. Этот протокол описывает разработку и проверку assay для высокопроизводительного скрининга RNAi в mammalian клеток, основные соображения и этапы подготовки, важное значение для проведения начального экрана RNAi высокой пропускной способности и шаг за шагом руководство для проведение основной экран RNAi высокой пропускной способностью; Кроме того он широко описаны методы для проведения проверки вторичного экрана и третичного проверки исследований. В интересах RNAi высокопроизводительного скрининга является, что она позволяет каталог, в обширной и беспристрастной моды, принимающей факторы, которые модулируют любой аспект вирусной репликации, для которого можно разработать в vitro assay например инфективности, лопнул размер, и цитотоксичность. Он имеет право раскрыть биотерапевтической целей непредвиденных на основе современных знаний.
Высокопроизводительного скрининга RNAi генома общесистемной оказался бесценным инструментом для выявления биологических идеи в различных областях исследований, включая вирус биологии. За последние десять лет или около того многочисленные группы провели на основе ячеек крупномасштабных RNAi скрининг широко определить хост генов, которые модулируют репликации вируса (Проверено в1,2,3,4 , 5 , 6 , 7). интересно, что большое количество этих экранов были проведены в раковые клетки и несколько с вирусами, которые являются текущие онколитического вирус кандидатов, включая vaccinia вируса8,9,10 , Миксома вирус11, вирус простого герпеса12,13,вирус везикулярного стоматита14и Мараба вирус15. Хотя основное внимание в большинстве этих исследований на определении узла факторов, которые влияют некоторые аспекты репликации вируса и не на выявлении биотерапевтической цели для повышения онколитического вирус терапии, ценные данные могут быть заминированы из этих наборов данных в этой связи. Ясно, что мощный потенциал для идентификации узла цели, которые можно манипулировать для повышения онколитического терапии вирус не был полностью задействован.
Множество платформ вируса онколитического в настоящее время испытываются в доклинических и клинических исследований, включая симплекс вирус, реовирусной и vaccinia вируса герпеса, которые имели ощутимый успех в поздней стадии клинических испытаний. Для большинства из этих платформ усилия были направлены на изменяя геномов вируса для повышения терапии. Например для увеличения специфичности опухолей, конкретные вирус гены были удалены или мутировал значительно ограничить вирусной репликации в нормальных клеток, но не в опухолевых клетках. В некоторых случаях, как ГМ-КСФ (гранулоцитарный макрофагальный колониестимулирующий фактор) для полифункциональное иммунный ответ или NIS (Симпорт йодида натрия) для включения в vivo изображений и клеточных radioiodide поглощения были добавлены трансгенов для терапевтических целей. Однако там было очень мало работы сосредоточены на манипулирование хост/опухоль гены и изучает влияние генов хост/опухоли на репликацию вируса онколитического. С появлением технологии высокопроизводительного скрининга, теперь это возможно прозондирует область взаимодействия хост вирус в масштабе генома и расшифровать возможность манипулировать геном хоста для повышения онколитического вирус терапии (пересмотрена в16, 17,18).
Мы сообщили первый исследование демонстрирует доказательства в концепция использования высокопроизводительных генетический скрининг для выявления узла цели, которые могут быть использованы для повышения онколитического вирус терапии. Чтобы обнаружить узел генов, которые модулируют Мараба вирус oncolysis, онколитического rhabdovirus, в настоящее время проходит испытания в фазе I и II испытаний, мы провели генома общесистемной RNAi экраны через три различных опухолевых клеток линии в двух экземплярах с интерферирующей (короткая вмешательства РНК) Библиотека, ориентация 18,120 генов15. Путь анализ хитов, определены в экранах показал обогащение членов ER (эндоплазматического ретикулума) стресс ответ пути. Мы выбрали 10 хитов в течение этих путей для вторичной проверки с использованием малых интерферирующих РНК с различными таргетинга последовательности от тех из основного экрана. В рамках третичной проверки, мы провели эксперимент спасения с IRE1α (инозит требуя фермента 1 альфа), чтобы подтвердить, что хит на целевом. В пробирке и в vivo тестирование с помощью маленькой молекулы ингибитор IRE1α привели к усовершенствованными онколитического эффективность.
Workenhe и др. 12 также провел геном-RNAi Широкоэкранные с помощью пула лентивирусные индуцируемый (коротких шпильки РНК) библиотека ориентации 16,056 генов для идентификации узла факторов, ограничивающих вирус герпеса человека типа 1 (ВПГ-1) мутантный при посредничестве KM100 oncolysis груди раковые клетки. В основном экране они определили 343 генов нокдаун которые приводят к расширенной цитотоксичность KM100-инфицированных клеток на макет инфицированных клеток; они выбрали 24 этих генов для вторичной проверки. Из 24 генов, 8 гены были подтверждены на вторичный экрана с одним из них является SRSF2 (Серин/аргинин богатые сплайсинга фактор 2), которое впоследствии было подтверждено с помощью генетических спасения эксперимента во время третичного проверки. Группа поехала для выявления ДНК ингибитор топоизомеразы химиотерапевтических, сократить фосфорилирование SRSF2 и показали, что сочетание лечения HSV-1 KM100 с ингибитором привело к расширенной выживания TUBO опухоли подшипник мышей.
В вышеупомянутых исследований последовали аналогичные рабочего процесса. Каждый начал с первичной геном-RNAi Широкоэкранные последовал второй экран выберите количество хитов, определены в основном экране. Последовал третичного проверки исследований, которые включены, подтверждающий, что хит был на цель, выполняя генетических спасти эксперименты в пробирке с конечной проверки, осуществляется путем манипулирования целевого гена продукт в естественных условиях. В этой статье мы сначала предоставить общий протокол для разработки и проверки анализа малых интерферирующих РНК скрининг высокой пропускной способности, которая включает в себя определение условий оптимального трансфекции, количество вируса и длина инфекции. Мы также предлагаем подробный протокол для проведения основного экрана высок объём siRNA, а также общее описание метода для выполнения проверки вторичного экрана и третичного проверки.
Здесь мы представляем собой протокол для применения высокопроизводительного скрининга RNAi для идентификации узла цели, которые можно манипулировать для повышения онколитического вирус терапии. Это была успешно протестирована с онколитического Мараба вирус и онколитического vaccinia ви?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантов из Онтарио института для исследований рака, Канадский фонд для инноваций, Оттава региональный фонд рака и Терри Фокс научно-исследовательский институт. K.J.A. была поддержана Ванье Канада аспирантов стипендии, Канадский институт медицинских исследований-мастер премию и Онтарио Магистратура стипендии.
Consumables | |||
siRNA library | GE Dharmacon | G-005005-02 | |
Corning 384-well plate | Corning | 3985 | |
Falcon 384-well plate | Becton Dickinson | 353962 | |
Water | Sigma | W4502 | |
siGenome SMARTpool PLK1 | GE Dharmacon | M-003290-01 | |
AllStars Negative Control siRNA | Qiagen | SI03650318 | |
siGenome Non-targeting siRNA Pool #2 | GE Dharmacon | D-001206-14-20 | |
DMEM/HIGH Glucose | GE Healthcare Life Sciences | SH30022.01 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma | F15051-500ML | |
HEPES solution (1M) | Sigma | H3535-100ML | |
Penicillin-Streptomycin 100X solution | GE Healthcare Life Sciences | SV30010 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 2500056 | |
DPBS/Modified | GE Healthcare Life Sciences | SH30028.02 | |
Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778100 | |
Oligofectamine | Thermo Fisher Scientific | 1225011 | |
Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 22600-050 | |
Resazurin sodium salt | Sigma | R7017-5G | |
Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H21492 | |
Formaldehyde (37% by weight) | Fisher Scientific | F79-4 | |
500 ml bottles | Corning | 430282 | |
Adhesive Sealing Film For Microplates | Excel Scientific | 361006007 | |
Peelable Heat Sealing Foil | Thermo Fisher Scientific | AB-3720 | |
BioTek MicroFlo Select Dispenser cassette | Fisher Scientific | 11-120-625 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
MicroFlo Select (liquid dispenser) | Fisher Scientific | 11120621 | |
BioTek Synergy HT plate reader | Biotek | N/A | |
Opera Imaging and Analysis Instrument | PerkinElmer | HH10000115 | |
KiNEDx Robotic Arm | Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) | KX-300-660 | |
Cytomat 24C Series Automated Incubator | Thermo Fisher Scientific | 50080227 | |
JANUS Automated Workstation | PerkinElmer | AJI4M01 | |
Plate Carousel | Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) | N/A | |
Alps 3000 plate sealer | Thermo Fisher Scientific | AB-3000 |