هنا يمكننا وصف بروتوكول لاستخدام الفرز [رني] الفائق لكشف أهداف المضيف التي يمكن التلاعب بها لتعزيز العلاج الفيروسات أونكوليتيك، ويمكن على وجه التحديد رهابودفيروس واللقاحيه العلاج بالفيروسات، ولكن سهولة تكييفها للأخرى أونكوليتيك برامج الفيروسات أو لاكتشاف الجينات المضيفة التي تعدل النسخ المتماثل الفيروس عموما.
الفائق على نطاق الجينوم [رني] (تدخل الجيش الملكي النيبالي) فحص تكنولوجيا تستخدم على نطاق واسع لاكتشاف العوامل المضيفة التي تؤثر على فيروس النسخ المتماثل. نقدم هنا تطبيق هذه التكنولوجيا لكشف أهداف المضيف التي تعدل على وجه التحديد النسخ المتماثل من فيروس مارابا، رهابدوفيروس أونكوليتيك، وفيروس اللقاحية بهدف تعزيز العلاج. حين تم اختبار البروتوكول للاستخدام مع وفيروس مارابا أونكوليتيك أونكوليتيك اللقاحية، هذا النهج ينطبق على غيره من الفيروسات أونكوليتيك، ويمكن أيضا أن تستخدم لتحديد أهداف المضيف أن تعدل النسخ المتماثل الفيروس في خلايا الثدييات في العامة. ويصف هذا البروتوكول التنمية والتحقق من الصحة للفحص للفرز الفائق [رني] في خلايا الثدييات، والاعتبارات الرئيسية وإعداد خطوات هامة لإجراء شاشة [رني] الفائق الأولية، ودليل خطوة بخطوة إجراء شاشة [رني] الفائق الأولية؛ وباﻹضافة إلى ذلك، وهو يجمل على نطاق واسع أساليب لإجراء التحقق من صحة الشاشة الثانوية والدراسات الجامعية التحقق من الصحة. الاستفادة من الفحص هو أنه يسمح لأحد الكتالوج، بطريقة شاملة وغير متحيزة، عوامل المضيف أن تعدل أي جانب من النسخ المتماثل الفيروس الذي واحد يمكن أن تتطور فحص في المختبر مثل العدوى، [رني] الفائق انفجر الحجم، وسيتوتوكسيسيتي. لديه القدرة على كشف biotherapeutic أهدافا غير متوقعة استناداً إلى المعرفة الحالية.
الفرز الفائق على نطاق الجينوم [رني] ثبت أن تكون أداة لا تقدر بثمن للكشف عن رؤى البيولوجي في مجالات متنوعة للدراسة بما في ذلك فيروس البيولوجيا. على مدى العقد الماضي أو نحو ذلك، قامت العديد من الجماعات يستند إلى الخلية الفرز [رني] على نطاق واسع على نطاق واسع في تحديد الجينات المضيفة التي تعدل فيروس النسخ المتماثل (المراجعة في1،2،3،4 , 5 , 6 , 7)-من المثير للاهتمام، وعدد كبير من هذه الشاشات أجريت في الخلايا السرطانية والعديد من فيروسات الحالي أونكوليتيك الفيروسات المرشحة بما في ذلك اللقاحية الفيروسات8،9،10 ، ميكسوما الفيروسات11فيروس الحلأ البسيط12،13،فيروس التهاب الفم الحويصلي14ومارابا الفيروس15. بينما كان تركيز معظم هذه الدراسات على تحديد العوامل المضيفة التي تؤثر على بعض جوانب فيروس النسخ المتماثل وليس على تحديد أهداف بيوثيرابيوتيك لتعزيز العلاج فيروس أونكوليتيك، يمكن أن تستخرج بيانات قيمة من هذه المجموعات من البيانات في هذا الصدد. فمن الواضح أن إمكانات قوية لتحديد أهداف المضيف التي يمكن التلاعب بها لتعزيز أونكوليتيك الفيروس العلاج لم تستغل بالكامل.
ويجري حاليا اختبار عدد كبير منصات فيروس أونكوليتيك في الدراسات السريرية والسريرية بما في ذلك فيروس القوباء الفيروسات، ريوفيروس واللقاحيه البسيط، الذي كان النجاح الملموس في وقت متأخر من مرحلة التجارب السريرية. لغالبية هذه المنابر، توجه الجهود نحو تغيير جينومات الفيروس لتعزيز العلاج. على سبيل المثال، لزيادة نوعية الورم، جينات الفيروس محددة تم حذف أو تحور لتحد بشكل كبير الفيروسية النسخ المتماثل في الخلايا الطبيعية، ولكن ليس في الخلايا السرطانية. في بعض الحالات، تم إضافة المتسلسلات مثل GM-CSF (عامل تحفيز مستعمرة بلعم المحببات) تحفيز الاستجابة المناعية أو شيكل (سيمبورتير يوديد الصوديوم) لتمكين فيفو في التصوير، وامتصاص راديويوديدي الخلوية للعلاج الأغراض. ومع ذلك، كان هناك القليل جداً العمل ركزت على التلاعب بالجينات المضيف/الورم واستكشاف أثر الجينات المضيف/ورم في أونكوليتيك فيروس النسخ المتماثل. ومع ظهور تكنولوجيا الفرز الفائق، فمن الممكن للتحقيق التفاعلات المضيف الفيروس على نطاق جينوم وفك فرصاً للتلاعب جينوم مضيف لتعزيز أونكوليتيك الفيروس العلاج الآن (استعرض في16، 17،18).
أبلغنا أول دراسة تبين دليل على المفهوم لاستخدام الفائق الوراثية الفحص لتحديد أهداف المضيف التي يمكن التلاعب بها لتعزيز العلاج فيروس أونكوليتيك. لاكتشاف الجينات المضيفة التي تعدل مارابا فيروس أونكوليسيس، رهابدوفيروس أونكوليتيك يجري اختباره حاليا في المرحلة الأولى والثاني المحاكمات، أجرينا شاشات [رني] على نطاق الجينوم عبر ثلاثة خطوط الخلايا الورم المختلفة في تكرار مع siRNA (التدخل في الجيش الملكي النيبالي قصيرة) مكتبة استهداف جينات 18,12015. كشف تحليل مسار الزيارات المحددة في الشاشات إثراء الأعضاء في مسارات استجابة الإجهاد ER (هيولى). اخترنا 10 مرات داخل هذه المسارات للثانوي التحقق من الصحة باستخدام siRNA مع تسلسل استهداف مختلفة عن تلك الخاصة بالشاشة الرئيسية. وكجزء من التحقق من التعليم العالي، وقد أجرينا تجربة إنقاذ مع IRE1α (التي تتطلب اينوزيتول ألفا إنزيم 1) للتأكد من أنه الضرب على الهدف. في المختبر و في فيفو الاختبار باستخدام مثبط جزيء صغير من IRE1α أسفرت عن فعالية أونكوليتيك زيادة هائلة.
ووركينهي et al. كما أجرى 12 شاشة [رني] على نطاق جينوم شرنا لينتيفيرال مجمعة (دبوس الشعر القصير الرنا) باستخدام مكتبة استهداف جينات 16,056 لتحديد العوامل المضيفة تقييد البشرية فيروس الهربس البسيط نوع 1 (هامبورغ-1) متحولة بوساطة KM100 أونكوليسيس من الثدي الخلايا السرطانية. في الشاشة الرئيسية، وحددوا الجينات 343 ضربة قاضية لتؤدي إلى سيتوتوكسيسيتي المعززة للخلايا المصابة KM100 عبر الخلايا المصابة وهمية؛ أنها اختارت 24 من هذه الجينات للتحقق من الثانوي. وتأكدت من أصل 24 الجينات، الجينات 8 في الشاشة الثانوية مع واحد منهم يجري SRSF2 (الربط سيرين/ارجينين–الغنية بعامل 2) الذي أكد في وقت لاحق باستخدام تجربة إنقاذ وراثية أثناء التحقق من التعليم العالي. توجهت المجموعة تحديد مثبط topoisomerase الحمض النووي التي العلاج الكيميائي التي خفضت الفسفرة SRSF2 وأظهرت أن علاج تركيبة KM100 هامبورغ-1 مع هذا المانع يؤدي إلى بقاء تمديد أنبوب الفئران الحاملة للورم.
وتلت في الدراسات السالفة الذكر، سير عمل مشابهة. وبدأت كل مع شاشة [رني] على نطاق جينوم أساسي متبوعاً شاشة ثانوية في عدد مختار من الزيارات المحددة في الشاشة الرئيسية. وتلت ذلك دراسات التعليم العالي التحقق من الصحة، التي تضمنت تأكيد أنه الضرب على الهدف قبل تنفيذ الوراثية الإنقاذ تجارب في المختبر مع التحقق من الصحة في نهاية المطاف يؤديها التلاعب المنتج الجينات المستهدفة في فيفو. في هذه المقالة، نحن نقدم أولاً بروتوكول عام للتنمية والتحقق منها مقايسة siRNA-الفرز الفائق، الذي ينطوي على تحديد شروط تعداء الأمثل، كمية الفيروس، وطول مدة الإصابة. نحن نقدم أيضا بروتوكول مفصلة لإجراء أولى شاشة siRNA الفائق، فضلا عن وصف عام لطريقة لإجراء التحقق من صحة الشاشة الثانوية والثالثية التحقق من صحة.
نقدم هنا بروتوكولا لتوظيف الفرز الفائق [رني] لتحديد أهداف المضيف التي يمكن التلاعب بها لتعزيز العلاج فيروس أونكوليتيك. وهذا قد تم اختباره بنجاح مع أونكوليتيك مارابا فيروس وفيروس اللقاحية أونكوليتيك، ولكن، كما ذكر، فإنه يمكن تكييفها للاستخدام مع غيره من الفيروسات أونكوليتيك أو غيره من ال…
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل منح مقدمة من معهد أونتاريو لبحوث السرطان، ومؤسسة كندا للابتكار، ومؤسسة مكافحة السرطان الإقليمي في أوتاوا، ومعهد أبحاث تيري فوكس. K.J.A. أيده على “كندا فانييه منحة الدراسات العليا”، المعهد الكندي لجائزة بحوث ماجستير من الصحة، و “منحة الدراسات العليا أونتاريو”.
Consumables | |||
siRNA library | GE Dharmacon | G-005005-02 | |
Corning 384-well plate | Corning | 3985 | |
Falcon 384-well plate | Becton Dickinson | 353962 | |
Water | Sigma | W4502 | |
siGenome SMARTpool PLK1 | GE Dharmacon | M-003290-01 | |
AllStars Negative Control siRNA | Qiagen | SI03650318 | |
siGenome Non-targeting siRNA Pool #2 | GE Dharmacon | D-001206-14-20 | |
DMEM/HIGH Glucose | GE Healthcare Life Sciences | SH30022.01 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma | F15051-500ML | |
HEPES solution (1M) | Sigma | H3535-100ML | |
Penicillin-Streptomycin 100X solution | GE Healthcare Life Sciences | SV30010 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 2500056 | |
DPBS/Modified | GE Healthcare Life Sciences | SH30028.02 | |
Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778100 | |
Oligofectamine | Thermo Fisher Scientific | 1225011 | |
Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 22600-050 | |
Resazurin sodium salt | Sigma | R7017-5G | |
Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H21492 | |
Formaldehyde (37% by weight) | Fisher Scientific | F79-4 | |
500 ml bottles | Corning | 430282 | |
Adhesive Sealing Film For Microplates | Excel Scientific | 361006007 | |
Peelable Heat Sealing Foil | Thermo Fisher Scientific | AB-3720 | |
BioTek MicroFlo Select Dispenser cassette | Fisher Scientific | 11-120-625 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
MicroFlo Select (liquid dispenser) | Fisher Scientific | 11120621 | |
BioTek Synergy HT plate reader | Biotek | N/A | |
Opera Imaging and Analysis Instrument | PerkinElmer | HH10000115 | |
KiNEDx Robotic Arm | Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) | KX-300-660 | |
Cytomat 24C Series Automated Incubator | Thermo Fisher Scientific | 50080227 | |
JANUS Automated Workstation | PerkinElmer | AJI4M01 | |
Plate Carousel | Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) | N/A | |
Alps 3000 plate sealer | Thermo Fisher Scientific | AB-3000 |