Summary

Cuantificación de endógeno auxina y citoquinina durante cultura de entrenudo de Ipecacuana

Published: March 15, 2018
doi:

Summary

Brotes adventicios pueden ser inducidas en los segmentos internodales de Ipecacuana sin tratamiento de fitohormonas. Para evaluar la dinámica de la fitohormona durante la formación de brotes adventicios, medimos endógeno auxina y citocinina en segmentos internodales por LC-MS/MS.

Abstract

Formación de brotes adventicios es una técnica importante para la propagación de cultivos de importancia económica y para la regeneración de plantas transgénicas. Tratamiento de fitohormonas se requiere para la inducción de brotes adventicios en la mayoría de las especies. Si se pueden inducir brotes adventicios se determina por el balance entre auxinas y citoquininas (CK) niveles. Mucho esfuerzo se va a determinar concentraciones óptimas y combinaciones de fitohormonas en cada tejido utilizado como explantes y en cada especie de planta. En jarabe de Ipecacuana, sin embargo, brotes adventicios se pueden inducir en los segmentos internodales en medio de cultivo sin tratamiento de fitohormonas. Esto permite la plasticidad inherente del jarabe de ipecacuana para la diferenciación de la célula ser evaluados. Para inducir brotes adventicios en el jarabe de Ipecacuana, nos cultiva segmentos internodales a 24 ° C con 15 μmol m−2 s−1 de la luz en un ciclo oscuro de 14 h luz/10-h en medio de B5 sin fitohormonas solidificado con la goma de gellan 0.2% durante 5 semanas. Para investigar la dinámica de la fitohormona durante la formación de brotes adventicios, medimos endógeno ácido indol-3-acético y CKs en los segmentos por líquido cromatografía-tandem espectrometría de masas LC-MS/MS. Este método permite el análisis de ácido indol-3-acético endógeno y CKs de una manera sencilla. Puede ser aplicado para investigar la dinámica de la auxina endógena y CK durante la organogénesis en otras especies vegetales.

Introduction

Gottlieb Haberlandt (1854-1945) propuso el concepto de “totipotencia”, por que las plantas las células pueden dividir, diferenciar y regenerar plantas enteras incluso después de su previa diferenciación en tipos celulares específicos en plantas maduras1. En cultivo de tejidos, si la regeneración de plantas puede ser inducida o no se determina por la combinación y concentración de fitohormonas exógeno aplicados en el medio de crecimiento. Skoog y Miller encontraron que se podían inducir brotes adventicios de callo de tabaco en el medio de cultivo que contiene una alta proporción de CKs a auxinas, mientras que se podían inducir raíces adventicias en medio que contiene una proporción baja de2. Desde aquel hallazgo, cultivo de tejidos ha sido ampliamente utilizado para la propagación de cultivos de importancia económica y para la regeneración de plantas transgénicas3. Pueden inducir brotes adventicios de tejidos que no sean de meristemo apical de brote, como hojas, raíces y entrenudos. Se requiere para la inducción de brotes adventicios en la mayoría de especies de plantas tratamiento de fitohormonas. Sin embargo, las concentraciones óptimas y combinaciones diferencian por especie y tejido utilizado como explantes. Por lo tanto, mucho esfuerzo va a determinar las concentraciones óptimas y combinaciones de fitohormonas para experimentos.

Carapichea ipecacuanha (Brot.) L. Andersson (Ipecacuana) es una planta medicinal que contiene alcaloides como la emetina y la cefalina, principalmente en las raíces4. Extractos de la raíz se utilizan como expectorante, emético y un amoebicide5. Aunque Ipecacuana crece naturalmente en las selvas tropicales de Brasil, es reacio a establecer las semillas en la cultura, y la tasa de germinación disminuye durante el almacenamiento de la semilla en Japón, con su frío clima6. En cambio, se propaga por cultivo de tejidos, en adventicias que dispara la formación de entrenudos es el método más eficiente7,8. Curiosamente, se pueden inducir brotes adventicios en esta especie sin fitohormonas tratamiento8.

Brotes adventicios se forman en la epidermis de la región apical de los segmentos internodales sin callusing, pero no en la región basal9. Esta diferencia indica polaridad de tejido en los segmentos internodales, que es probablemente bajo Reglamento fitohormonal. El sistema de cultivo de jarabe de Ipecacuana permite una oportunidad única para analizar cambios en los niveles de fitohormonas endógenas durante la formación de brotes adventicios. Aquí presentamos nuestro método para el análisis de los niveles endógenos de una auxina (ácido indol-3-acético (AIA)) y cuatro CKs (isopentenyl adenina (iP), isopentenyl adenina riboside (iPR), trans-zeatina (tZ) y trans-riboside zeatina (tZR)) en los segmentos internodales mediante LC-MS/MS.

Protocol

Nota: Jarabe de Ipecacuana (C. ipecacuanha) fue utilizado en este estudio porque facilita el análisis de fitohormonas endógenas. 1. crecimiento condiciones para inducir brotes adventicios de Ipecacuana Preparar medio de B5 sin phytohormone ajustado a pH 5.710y agregar 0.2% la goma de gellan. Esterilice en autoclave. Vierta 25 mL del medio esterilizado en una placa Petri estéril (90 mm × 20 mm). Corte 8 mm segmentos internodales…

Representative Results

En la 1 semana dest , no habían formado brotes adventicios. En la semana 2nd , aparecieron pequeños brotes. En el 3rd y 4 semanas demayo , el número de brotes mayor sobre todo en las regiones apicales (I y II) (figura 2A). Enla semana 5, el número de brotes fue aproximadamente 7 en región I y 5 en la región II (figura 2B). En cambio, s?…

Discussion

Para identificar la distribución de fitohormonas en la organogénesis, es importante utilizar materiales de la planta en la que puede observarse en medio libre de fitohormonas, organogénesis porque cuando fitohormonas exógeno se aplican a los explantes para la inducción de brotes o raíces, afectan el explante entero, lo que hace difícil evaluar la plasticidad inherente de las plantas en la diferenciación celular y organogénesis. Brotes adventicios pueden ser inducidos en medios de cultivo libres de fitohormonas e…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos al Sr. Akira Murakami del Departamento de Biociencias Aplicadas, la Universidad de Toyo y el Sr. Koudai Taniguchi del centro de tecnología agrícola de Gunma su asistencia técnica. Agradecemos también al profesor Shosaku Kashiwada y Dr. Uma Maheswari Rajagopalan, Universidad de Toyo por sus sugerencias. Este estudio fue apoyado en parte por el centro de investigación para la vida y ciencias ambientales, Universidad de Toyo.

Materials

[2H5]indole-3-acetic acid Olchemlm Ltd 031 1531 Internal standard for LC-MS/MS
[2H5]trans-zeatin Olchemlm Ltd 030 0301 Internal standard for LC-MS/MS
[2H5]trans-zeatin riboside Olchemlm Ltd 030 0311 Internal standard for LC-MS/MS
[2H6]N6-isopentenyl adenine Olchemlm Ltd 030 0161 Internal standard for LC-MS/MS
[2H6]N6-isopentenyl adenosine Olchemlm Ltd 030 0171 Internal standard for LC-MS/MS
indole-3-acetic acid Wako 098 00181 standard for LC-MS/MS
trans-zeatin SIGMA-ALDRICH Z0876 5MG standard for LC-MS/MS
trans-zeatin riboside Wako 262 01081 standard for LC-MS/MS
N6-isopentenyl adenine SIGMA-ALDRICH D7674 1G standard for LC-MS/MS
N6-isopentenyl adenosine ACROS ORGANICS 22648 1000 standard for LC-MS/MS
acetonitrile hypergrade for LC-MS LiChrosolv MERCK 1.00029.1000 solvent for LC-MS/MS
Water for chromatography LiChrosolv MERCK 1.15333.1000 solvent for LC-MS/MS
HPLC SHIMADZU Prominence
MS Sciex 3200QTRAP
Oasis HLB 30 mg/1 cc Waters WAT094225 cartridge column
Oasis MCX 30 mg/1 cc Waters 186000252 cartridge column
screw neck total recovery vial Waters 186002805
blue, 12 x 32mm screw neck cap and PTFE/silicone septum Waters 186000274
Acquity UPLC BEH C18, 2.1×100 mm Waters 186002350 UPLC column
Proshell 120 EC-C18, 2.1×50 mm Agilent 699775-902 UPLC column
Digital microscope Leica DHS1000
TissueLyser II QIAGEN 85300
Surgical blade Feather No. 22
Scalpel handle Feather No. 4
Savant SpeedVac/Refregerated vapor trap Thermo Fisher Scientific SPD111/RVT4104 vacuum concentrartor
Disposable glass tobe (13×100 mm) IWAKI 9832-1310
Sterile petri dish INA OPTICA I-90-20

References

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Cite This Article
Koike, I., Shimomura, K., Umehara, M. Quantification of Endogenous Auxin and Cytokinin During Internode Culture of Ipecac. J. Vis. Exp. (133), e56902, doi:10.3791/56902 (2018).

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