Summary

Quantificação de auxina endógena e citocinina durante Internode cultura de ipeca

Published: March 15, 2018
doi:

Summary

Brotos adventícios podem ser induzidos em segmentos internodal de ipeca sem tratamento phytohormone. Para avaliar a dinâmica phytohormone durante formação de tiro acidental, medimos endógena auxina e citocinina em segmentos internodal por LC-MS/MS.

Abstract

Formação de tiro acidental é uma técnica importante para a propagação de culturas economicamente importantes e a regeneração de plantas transgênicas. Tratamento de phytohormone é necessário para a indução de brotos adventícios na maioria das espécies. Se os brotos adventícios podem ser induzidos é determinado pelo saldo entre a auxina e citocinina (CK) níveis. Muito esforço vai para determinar concentrações óptimas e combinações de fitohormônios em cada tecido usado como explantes e em cada espécie de planta. Em ipecac, no entanto, brotos adventícios podem ser induzidos em segmentos internodal em meio de cultura sem tratamento phytohormone. Isso permite que a plasticidade inerente de ipeca para diferenciação de célula a ser avaliada. Para induzir os brotos adventícios em ipecac, nós cultivadas internodal segmentos a 24 ° C sob 15 µmol m− 2 s− 1 de luz em um ciclo escuro da luz/10-h 14-h phytohormone livre B5 meio solidificado com 0,2% gelano por 5 semanas. Para investigar a dinâmica phytohormone durante formação de tiro acidental, medimos endógeno ácido indol-3-acético e CKs nos segmentos por líquido espectrometria de massa em tandem-cromatografia de LC-MS/MS. Este método permite a análise de ácido indol-3-acético endógeno e CKs níveis de forma simples. Pode ser aplicado para investigar a dinâmica de auxina endógena e CK durante a organogênese em outras espécies de plantas.

Introduction

Gottlieb Haberlandt (1854-1945) propôs o conceito de “totipotência”, pela qual planta células podem dividir, diferenciar e regenerar plantas inteiras mesmo após sua prévia diferenciação em tipos de células específicas em plantas maduras1. Em cultura de tecidos, se planta regeneração pode ser induzida ou não é determinada pela combinação e concentração de fitohormônios exogenamente aplicadas no meio de crescimento. Skoog e Miller encontraram que brotos adventícios poderiam ser induzidos de tabaco calo no meio de cultura contendo uma alta proporção de CKs de auxinas, Considerando que raízes adventícias poderiam ser induzidas em meio contendo uma baixa relação2. Desde essa constatação, cultura de tecidos foi amplamente utilizada para a propagação de culturas economicamente importantes e a regeneração de plantas transgénicas3. Brotos adventícios podem ser induzidos a partir de tecidos que não sejam o meristema apical de tiro, como folhas, raízes e entrenós. Tratamento de phytohormone é necessário para a indução de brotos adventícios na maioria das espécies de plantas. No entanto, o ideais concentrações e combinações diferem por espécie e entre tecidos utilizados como explantes. Assim, muito esforço vai para determinação da concentração ideal e combinações de fitohormônios para experimentos.

Carapichea ipecacuanha (Brot.) L. Andersson (ipecacuanha) é uma planta medicinal que contém alcaloides como Emetina e a Cefalina, principalmente no raízes4. Extratos de raiz são usados como um expectorante, um emético e um amoebicide5. Embora ipecac cresce naturalmente nas florestas tropicais do Brasil, é relutante em conjunto de sementes na cultura, e a taxa de germinação diminui durante o armazenamento de sementes no Japão, com seus de clima mais frio6. Em vez disso, ele é propagado por cultura de tecidos, no qual adventícios atirar formação em entrenós é o mais eficiente método de7,8. Curiosamente, os brotos adventícios podem ser induzidos nesta espécie sem phytohormone tratamento8.

Brotos adventícios são formados na epiderme na região apical dos segmentos internodal sem callusing, mas não na região basal9. Esta diferença indica a polaridade do tecido em segmentos internodal, que é, provavelmente, ao abrigo do Regulamento fitohormonal. O sistema de cultura de ipecac permite uma oportunidade única para analisar as alterações nos níveis endógenos phytohormone durante formação de tiro acidental. Aqui apresentamos nosso método para a análise dos níveis endógenos de uma auxina (ácido indol-3-acético (IAA)) e quatro CKs (isopentenilo adenina (iP), Ribosídica de adenina de isopentenilo (iPR), trans-Zeatina (tZ) e trans-Zeatina Ribosídica (tZR)) em segmentos internodal através do uso de LC-MS/MS.

Protocol

Nota: Poaia (ipecacuanha c.) foi usada neste estudo porque facilita a análise de fitohormônios endógenas. 1. crescimento condições para induzir brotos adventícios de ipeca Prepare phytohormone livre B5 médio ajustado ao pH 5.710e adicionar gelano 0,2%. Esterilize em autoclave. Despeje uma placa de Petri estéril (90 mm × 20 mm), 25 mL do meio de autoclave. Corte-8mm internodal segmentos de plântulas de ipecac, usando um bi…

Representative Results

Em 1 semanast , sem brotos adventícios tinham formado. Na semana de 2nd , pequenos brotos apareceram. O 3rd e 4 semanas deth , o número de tiros aumento principalmente nas regiões apicais (I e II)(Figura 2). Na semana de 5th , o número de brotos foi aproximadamente 7 em região eu e 5 na região II (Figura 2B). Em contraste, apenas alguns…

Discussion

Para identificar a distribuição dos fitohormônios envolvidos na organogênese, é importante o uso de materiais vegetais em que organogênese pode ser observado na média phytohormone-livre, porque quando os fitohormônios são exogenamente aplicados a explantes para induzir brotos ou raízes, elas afetam o explante todo, tornando-se difícil avaliar a plasticidade inerente de plantas na diferenciação celular e organogênese. Brotos adventícios podem ser induzidos em meios de cultura livre phytohormone em outras es…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nós estamos gratos ao Sr. Akira Murakami do departamento de Biociências aplicadas, Universidade de Toyo e Sr. Koudai Taniguchi do centro de tecnologia agrícola de Gunma para sua assistência técnica. Nós também estamos gratos ao Professor Shosaku Kashiwada e Dr. Uma Maheswari Rajagopalan, Universidade Toyo para suas sugestões. Este estudo foi suportado em parte pelo centro de pesquisa para a vida e ciências ambientais, Universidade de Toyo.

Materials

[2H5]indole-3-acetic acid Olchemlm Ltd 031 1531 Internal standard for LC-MS/MS
[2H5]trans-zeatin Olchemlm Ltd 030 0301 Internal standard for LC-MS/MS
[2H5]trans-zeatin riboside Olchemlm Ltd 030 0311 Internal standard for LC-MS/MS
[2H6]N6-isopentenyl adenine Olchemlm Ltd 030 0161 Internal standard for LC-MS/MS
[2H6]N6-isopentenyl adenosine Olchemlm Ltd 030 0171 Internal standard for LC-MS/MS
indole-3-acetic acid Wako 098 00181 standard for LC-MS/MS
trans-zeatin SIGMA-ALDRICH Z0876 5MG standard for LC-MS/MS
trans-zeatin riboside Wako 262 01081 standard for LC-MS/MS
N6-isopentenyl adenine SIGMA-ALDRICH D7674 1G standard for LC-MS/MS
N6-isopentenyl adenosine ACROS ORGANICS 22648 1000 standard for LC-MS/MS
acetonitrile hypergrade for LC-MS LiChrosolv MERCK 1.00029.1000 solvent for LC-MS/MS
Water for chromatography LiChrosolv MERCK 1.15333.1000 solvent for LC-MS/MS
HPLC SHIMADZU Prominence
MS Sciex 3200QTRAP
Oasis HLB 30 mg/1 cc Waters WAT094225 cartridge column
Oasis MCX 30 mg/1 cc Waters 186000252 cartridge column
screw neck total recovery vial Waters 186002805
blue, 12 x 32mm screw neck cap and PTFE/silicone septum Waters 186000274
Acquity UPLC BEH C18, 2.1×100 mm Waters 186002350 UPLC column
Proshell 120 EC-C18, 2.1×50 mm Agilent 699775-902 UPLC column
Digital microscope Leica DHS1000
TissueLyser II QIAGEN 85300
Surgical blade Feather No. 22
Scalpel handle Feather No. 4
Savant SpeedVac/Refregerated vapor trap Thermo Fisher Scientific SPD111/RVT4104 vacuum concentrartor
Disposable glass tobe (13×100 mm) IWAKI 9832-1310
Sterile petri dish INA OPTICA I-90-20

References

  1. Haberlandt, G. Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitzungsber. Math.-Naturwiss. Kl. Akad. Wiss. Wien. 111, 69-92 (1902).
  2. Skoog, F., Miller, C. O. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. Symp Soc Exp Biol. 11, 118-130 (1957).
  3. Ganeshan, S., Caswell, K. L., Kartha, K. K., Chibbar, R. N., Khachatourians, G. G., McHughen, A., Scorza, R., Nip, W. K. . Transgenic plants and crops. , 69-84 (2002).
  4. Teshima, D., Ikeda, K., Satake, M., Aoyama, T., Shimomura, K. Production of emetic alkaloid by in vitro culture of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 278-280 (1988).
  5. Chatterjee, S. K., Nandi, R. P., Ghosh, N. C., Atal, C. K., Kapur, B. M. Cultivation and utilixzation of medicinal plants. Regional Research Laboratory, Council of Scientific and Industrial Research. , 295-301 (1982).
  6. Yoshimatsu, K., Shimomura, K., Bajaj, Y. P. S. . Biotechnology in Agriculture and Forestry 21, Medicinal and Aromatic Plants IV. , 87-103 (1993).
  7. Ideda, K., Teshima, D., Aoyama, T., Satake, M., Shimomura, K. Clonal propagation of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 288-291 (1988).
  8. Yoshimatsu, K., Shimomura, K. Efficient shoot formation on internodal segments and alkaloid formation in the regenerates of Cephaelis ipecacuanha A. Richard. Plant Cell Rep. 9 (10), 567-570 (1991).
  9. Koike, I., Taniguchi, K., Shimomura, K., Umehara, M. Dynamics of endogenous indole-3-acetic acid and cytokinins during adventitious shoot formation in ipecac. J. Plant Growth Regul. , (2017).
  10. Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50 (1), 151-158 (1968).
  11. Watad, A. A., et al. Adventitious shoot formation from carnation stem segments: a comparison of different culture procedures. Scientia Hortic. 65 (4), 313-320 (1996).
  12. Ajithkumar, D., Seeni, S. Rapid clonal multiplication through in vitro axillary shoot proliferation of Aegle marmelos (L.) Corr., a medicinal tree. Plant Cell Rep. 17 (5), 422-426 (1998).
  13. Tiwari, V., Tiwari, K. N., Singh, B. D. Comparative studies of cytokinins on in vitro propagation of Bacopa monniera. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 66 (1), 9-16 (2001).
  14. Rao, M. S., Purohit, S. D. In vitro shoot bud differentiation and plantlet regeneration in Celastrus paniculatus Willd. Biol. Plant. 50 (4), 501-506 (2006).
  15. Sanikhani, M., Frello, S., Serek, M. TDZ induces shoot regeneration in various Kalanchoë blossfeldiana Poelln cultivars in the absence of auxin. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 85 (1), 75-82 (2006).
  16. Yoshimoto, K., et al. Autophagy negatively regulates cell death by controlling NPR1-dependent salicylic acid signaling during senescence and the innate immune response in Arabidopsis. Plant Cell. 21 (9), 2914-2927 (2009).
  17. Schaller, G. E., Bishopp, A., Kieber, J. J. The yin-yang of hormones: cytokinin and auxin interactions in plant development. Plant Cell. 27 (1), 44-63 (2015).

Play Video

Cite This Article
Koike, I., Shimomura, K., Umehara, M. Quantification of Endogenous Auxin and Cytokinin During Internode Culture of Ipecac. J. Vis. Exp. (133), e56902, doi:10.3791/56902 (2018).

View Video