Summary

Количественная оценка эндогенного ауксинов и цитокининов во время Internode культуры Ipecac

Published: March 15, 2018
doi:

Summary

Случайного побегов может быть наведено на интермодального сегменты ipecac без лечения фитогормона. Для оценки динамики фитогормона во время формирования случайного стрелять, мы измерили эндогенного ауксинов и цитокининов интермодального сегментов, LC-MS/MS.

Abstract

Формирование случайного стрелять является важным методом распространения экономически важных культур и для регенерации трансгенных растений. Фитогормона лечение требуется для индукции случайного побегов в большинстве видов. Ли случайного побеги могут быть наведено определяется баланс между ауксинов и цитокининов (CK) уровнях. Много усилий уходит в определении оптимальной концентрации и комбинации фитогормонов в каждой ткани, используется в качестве эксплантов и каждого вида растений. В ipecac однако, случайного побегов может быть наведено на интермодального сегментов в культурной среде без лечения фитогормона. Это позволяет присущие пластичности ipecac для дифференцировки клеток оцениваться. Чтобы побудить случайного стреляет в ipecac, мы культивировали интермодального сегментов при 24 ° C под 15 мкмоль m−2 s−1 света в цикле Темный свет/10-h 14-h на свободных фитогормона B5 средних затвердевших с 0,2% gellan резинки на 5 недель. Расследовать фитогормона динамика во время формирования случайного стрелять, мы измерили эндогенного индол-3-уксусной кислоты и CKs в сегментах по жидкостной хроматографии тандем масс-спектрометрии LC-MS/MS. Этот метод позволяет анализа эндогенных индол-3-уксусной кислоты и уровни CKs в простой форме. Он может применяться для изучения динамики эндогенного ауксинов и CK период органогенеза в других видов растений.

Introduction

Готлиб Иоганн Фридрих Хаберландт (1854-1945) предложил концепцию «тотипотентность», по которой завод клетки можно разделить, дифференцировать и регенерации целых заводов даже после их предварительного дифференциации в типы конкретных клеток в зрелых растений1. В культуре ткани ли регенерации растений может быть наведено или не определяется сочетание и концентрации экзогенно прикладной фитогормонов в среднего роста. Скуг и Миллер обнаружил, что случайного побеги могут быть вызваны из табака каллуса на питательной среды, содержащие высокий коэффициент CKs в ауксины, тогда как придаточных корней может быть наведено на носителе, содержащих низкий коэффициент2. После этого вывода, тканевой культуры широко используется для распространения экономически важных культур и для регенерации трансгенных растений3. Случайного побегов может быть вызван из тканей помимо стрелять апикальной Меристемы, например, листья, корни и междоузлий. Фитогормона лечение требуется для индукции случайного побегов в большинстве видов растений. Однако оптимальной концентрации и комбинации отличаются по видам и среди тканей, используемых в качестве эксплантов. Таким образом много усилий уходит в определении оптимальной концентрации и комбинации фитогормонов для экспериментов.

Ипекакуана (Brot.) L. Андерссон (ipecac) это лекарственное растение, содержит алкалоиды, как эметин и cephaeline, главным образом в корни4. Экстракты корня используются как отхаркивающее, рвотное и amoebicide5. Хотя ipecac Естественно произрастает в тропических лесах Бразилии, он неохотно установить семена в культуре, и всхожесть снижается во время хранения семян в Японии, с ее холоднее климат6. Вместо этого он распространяется на культуре ткани, в которой случайного стрелять формирование на междоузлий является наиболее эффективным методом7,8. Интересно, что в этот вид без фитогормона лечения8может быть наведено случайного побегов.

Случайного побеги образуются на эпидермис в регионе апикальной интермодального сегментов без callusing, но не в базальной области9. Эта разница указывает ткани полярности в интермодального сегментов, который, вероятно, под фитогормональный регулирования. Ipecac культуры система позволяет уникальная возможность анализировать изменения уровня эндогенного фитогормона во время формирования случайного стрелять. Здесь мы представляем наш метод для анализа эндогенными уровнями одного ауксинов (индол-3-уксусной кислоты (IAA)) и четыре CKs (изопентенил аденин (iP), изопентенил riboside аденин (ПИС), транс-Зеатин (tZ) и транс-Зеатин riboside (ТЗР)) в интермодального сегментов с помощью LC-MS/MS.

Protocol

Примечание: Ipecac (C. Ипекакуана) был использован в этом исследовании, потому что он облегчает анализ эндогенного фитогормонов. 1. рост условия чтобы побудить случайного побеги Ipecac Подготовка бесплатно фитогормона B5 среднего скорректирована с рН 5,710и …

Representative Results

В 1 неделеst сформировали не случайного побегов. На 2-й неделе появились небольшие побегов. 3rd и 4-й недели, количество побегов увеличение главным образом в апикальной регионах (I и II)(Рисунок 2). На 5-й недели число побег…

Discussion

Чтобы определить распределение фитогормонов участвующих в органогенез, важно использовать растительные материалы, в которых органогенеза можно наблюдать на фитогормона свободной среде, потому что когда фитогормонов экзогенно применяются к эксплантов для стимулирования побеги и ко?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарны г-н Акира Мураками кафедры прикладной Biosciences, Университета Тойо и г-н Koudai Танигути Гумма центра сельскохозяйственной технологии для их технической помощи. Мы признательны также профессором Shosaku Kashiwada и доктор Uma Елена Раджагопалан, Университетом Тойо за их предложения. Это исследование было поддержано в части научно-исследовательский центр для жизни и экологических наук, Университет Тойо.

Materials

[2H5]indole-3-acetic acid Olchemlm Ltd 031 1531 Internal standard for LC-MS/MS
[2H5]trans-zeatin Olchemlm Ltd 030 0301 Internal standard for LC-MS/MS
[2H5]trans-zeatin riboside Olchemlm Ltd 030 0311 Internal standard for LC-MS/MS
[2H6]N6-isopentenyl adenine Olchemlm Ltd 030 0161 Internal standard for LC-MS/MS
[2H6]N6-isopentenyl adenosine Olchemlm Ltd 030 0171 Internal standard for LC-MS/MS
indole-3-acetic acid Wako 098 00181 standard for LC-MS/MS
trans-zeatin SIGMA-ALDRICH Z0876 5MG standard for LC-MS/MS
trans-zeatin riboside Wako 262 01081 standard for LC-MS/MS
N6-isopentenyl adenine SIGMA-ALDRICH D7674 1G standard for LC-MS/MS
N6-isopentenyl adenosine ACROS ORGANICS 22648 1000 standard for LC-MS/MS
acetonitrile hypergrade for LC-MS LiChrosolv MERCK 1.00029.1000 solvent for LC-MS/MS
Water for chromatography LiChrosolv MERCK 1.15333.1000 solvent for LC-MS/MS
HPLC SHIMADZU Prominence
MS Sciex 3200QTRAP
Oasis HLB 30 mg/1 cc Waters WAT094225 cartridge column
Oasis MCX 30 mg/1 cc Waters 186000252 cartridge column
screw neck total recovery vial Waters 186002805
blue, 12 x 32mm screw neck cap and PTFE/silicone septum Waters 186000274
Acquity UPLC BEH C18, 2.1×100 mm Waters 186002350 UPLC column
Proshell 120 EC-C18, 2.1×50 mm Agilent 699775-902 UPLC column
Digital microscope Leica DHS1000
TissueLyser II QIAGEN 85300
Surgical blade Feather No. 22
Scalpel handle Feather No. 4
Savant SpeedVac/Refregerated vapor trap Thermo Fisher Scientific SPD111/RVT4104 vacuum concentrartor
Disposable glass tobe (13×100 mm) IWAKI 9832-1310
Sterile petri dish INA OPTICA I-90-20

References

  1. Haberlandt, G. Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitzungsber. Math.-Naturwiss. Kl. Akad. Wiss. Wien. 111, 69-92 (1902).
  2. Skoog, F., Miller, C. O. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. Symp Soc Exp Biol. 11, 118-130 (1957).
  3. Ganeshan, S., Caswell, K. L., Kartha, K. K., Chibbar, R. N., Khachatourians, G. G., McHughen, A., Scorza, R., Nip, W. K. . Transgenic plants and crops. , 69-84 (2002).
  4. Teshima, D., Ikeda, K., Satake, M., Aoyama, T., Shimomura, K. Production of emetic alkaloid by in vitro culture of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 278-280 (1988).
  5. Chatterjee, S. K., Nandi, R. P., Ghosh, N. C., Atal, C. K., Kapur, B. M. Cultivation and utilixzation of medicinal plants. Regional Research Laboratory, Council of Scientific and Industrial Research. , 295-301 (1982).
  6. Yoshimatsu, K., Shimomura, K., Bajaj, Y. P. S. . Biotechnology in Agriculture and Forestry 21, Medicinal and Aromatic Plants IV. , 87-103 (1993).
  7. Ideda, K., Teshima, D., Aoyama, T., Satake, M., Shimomura, K. Clonal propagation of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 288-291 (1988).
  8. Yoshimatsu, K., Shimomura, K. Efficient shoot formation on internodal segments and alkaloid formation in the regenerates of Cephaelis ipecacuanha A. Richard. Plant Cell Rep. 9 (10), 567-570 (1991).
  9. Koike, I., Taniguchi, K., Shimomura, K., Umehara, M. Dynamics of endogenous indole-3-acetic acid and cytokinins during adventitious shoot formation in ipecac. J. Plant Growth Regul. , (2017).
  10. Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50 (1), 151-158 (1968).
  11. Watad, A. A., et al. Adventitious shoot formation from carnation stem segments: a comparison of different culture procedures. Scientia Hortic. 65 (4), 313-320 (1996).
  12. Ajithkumar, D., Seeni, S. Rapid clonal multiplication through in vitro axillary shoot proliferation of Aegle marmelos (L.) Corr., a medicinal tree. Plant Cell Rep. 17 (5), 422-426 (1998).
  13. Tiwari, V., Tiwari, K. N., Singh, B. D. Comparative studies of cytokinins on in vitro propagation of Bacopa monniera. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 66 (1), 9-16 (2001).
  14. Rao, M. S., Purohit, S. D. In vitro shoot bud differentiation and plantlet regeneration in Celastrus paniculatus Willd. Biol. Plant. 50 (4), 501-506 (2006).
  15. Sanikhani, M., Frello, S., Serek, M. TDZ induces shoot regeneration in various Kalanchoë blossfeldiana Poelln cultivars in the absence of auxin. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 85 (1), 75-82 (2006).
  16. Yoshimoto, K., et al. Autophagy negatively regulates cell death by controlling NPR1-dependent salicylic acid signaling during senescence and the innate immune response in Arabidopsis. Plant Cell. 21 (9), 2914-2927 (2009).
  17. Schaller, G. E., Bishopp, A., Kieber, J. J. The yin-yang of hormones: cytokinin and auxin interactions in plant development. Plant Cell. 27 (1), 44-63 (2015).

Play Video

Cite This Article
Koike, I., Shimomura, K., Umehara, M. Quantification of Endogenous Auxin and Cytokinin During Internode Culture of Ipecac. J. Vis. Exp. (133), e56902, doi:10.3791/56902 (2018).

View Video