Summary

Quantification de l’endogène auxine et cytokinine durant la Culture entre-nœud d’ipéca

Published: March 15, 2018
doi:

Summary

Des pousses adventives peuvent être induites sur les segments internodales d’ipéca sans traitement phytohormone. Pour évaluer la dynamique phytohormone au cours de la formation de pousses adventives, nous avons mesuré endogène auxine et cytokinine dans des segments internodales par LC-MS/MS.

Abstract

La formation de pousses adventives est une technique importante pour la propagation des cultures d’importance économique et à la régénération de plantes transgéniques. Phytohormone traitement est nécessaire à l’induction des pousses adventives dans la plupart des espèces. Si des pousses adventives peuvent être induites sont déterminée par l’équilibre entre auxine et cytokinine (CK) niveaux. Beaucoup d’efforts va dans la détermination des concentrations optimales et des combinaisons de phytohormones dans chaque tissu utilisé comme explants et dans chacune des espèces végétales. Dans ipecac, toutefois, des pousses adventives peuvent être induites sur internodales segments dans le milieu de culture sans traitement phytohormone. Cela permet la plasticité inhérente d’ipéca pour la différenciation des cellules doit être évaluée. Pour induire des pousses adventives en ipecac, nous cultivées internodales segments à 24 ° C sous 15 µmol m−2 s−1 de lumière dans un cycle de sombre lumière/10 h de 14 h sur un milieu B5 sans phytohormone solidifié avec gomme Gellane 0,2 % pendant 5 semaines. Pour étudier la dynamique phytohormone au cours de la formation de pousses adventives, nous avons mesuré l’acide indole 3-acétique endogène et CKs dans les segments par spectrométrie de masse en tandem par chromatographie liquide LC-MS/MS. Cette méthode permet l’analyse de l’acide indole 3-acétique endogène et CKs niveaux de manière simple. Il peut être appliqué afin d’étudier la dynamique de l’auxine endogène et CK pendant l’organogenèse chez d’autres espèces végétales.

Introduction

Gottlieb Haberlandt (1854-1945) a proposé le concept de « totipotence », par quelles plantes cellules peuvent diviser, différencier et régénérer des plantes entières même après leur différenciation préalable en types spécifiques de cellules de plantes matures1. En culture de tissus, si la régénération des plantes peut être induite ou non dépend de la combinaison et la concentration des phytohormones exogènes appliquées dans le milieu de croissance. Skoog et Miller ont constaté que des pousses adventives peuvent être induites de tabac cals sur milieu de culture contenant un taux élevé de CKs d’auxines, tandis que des racines adventives pouvaient être induites sur un milieu contenant un faible ratio2. Depuis cette conclusion, culture de tissus a été largement utilisée pour la propagation des cultures d’importance économique et pour la régénération des plantes transgéniques3. Des pousses adventives peuvent être induites de tissus autres que le méristème apical, tels que des feuilles, des racines et des entre-noeuds. Phytohormone traitement est nécessaire à l’induction des pousses adventives dans la plupart des espèces végétales. Toutefois, les combinaisons et les concentrations optimales diffèrent par espèce et entre les tissus utilisés comme explants. Ainsi, beaucoup d’efforts va en déterminer les concentrations optimales et les combinaisons de phytohormones pour des expériences.

Carapichea ipecacuanha (Brot.) L. Andersson (ipéca) est une plante médicinale qui contient des alcaloïdes tels qu’émétine et Céphéline, surtout dans les racines4. Extraits de racines sont utilisées comme expectorant, émétique et un amoebicide5. Bien que l’ipéca pousse naturellement dans les forêts tropicales du Brésil, il est réticent à mettre les graines dans la culture, et le taux de germination diminue pendant le stockage de semences au Japon, avec son de climat plus froid6. Au lieu de cela, il est propagé par culture de tissus, dans laquelle adventives tirer formation sur entre-noeuds est la plus efficace méthode de7,,8. Fait intéressant, les pousses adventives peuvent être induites chez cette espèce sans phytohormone traitement8.

Des pousses adventives sont forment sur l’épiderme dans la région apicale des segments internodales sans obtention, mais pas dans la région basale9. Cette différence indique les polarités de tissus dans les segments internodales, qui est probablement en vertu du règlement phytohormonal. Le système de culture d’ipéca permet une occasion unique d’analyser les changements dans les niveaux endogènes phytohormone au cours de la formation de pousses adventives. Ici, nous présentons notre méthode pour l’analyse des niveaux endogènes d’une auxine (acide indole 3-acétique (AIA)) et quatre CKs (isopentényl adénine (iP), isopentényl adénine riboside (iPR), trans-zéatine (tZ) et trans-zéatine riboside (tZR)) dans les segments internodales grâce à l’utilisation de CL-SM/SM.

Protocol

Remarque : Ipéca (c. ipécacuanha) a été utilisée dans cette étude, car elle facilite l’analyse des phytohormones endogènes. 1. croissance Conditions d’induire des pousses adventives d’ipéca Préparer un milieu B5 sans phytohormone ajusté à pH 5,710et ajoutez la gomme Gellane 0,2 %. Stériliser à l’autoclave. Verser 25 mL de milieu stérilisé dans une boîte de Petri stérile (90 × 20 mm). Couper des segments i…

Representative Results

À la 1st semaine, aucun des pousses adventives n’avaient formé. À la 2ème semaine, petites pousses sont apparus. À la 3rd et 4ème semaines, le nombre de pousses accru pour la plupart dans les régions apicales (I et II) (Figure 2A). À la 5e semaine, le nombre de pousses était approximativement 7 en région I et 5 dans la région II (Figure 2…

Discussion

Pour identifier la distribution des phytohormones impliqués dans l’organogenèse, c’est important d’utiliser des matières végétales dans lesquelles organogenèse peut être observé sur un milieu sans phytohormone, parce que quand les phytohormones sont appliqués exogène d’explants pour induire tiges ou racines, ils affectent l’explant entier, rendant difficile d’évaluer la plasticité inhérente des plantes dans la différenciation cellulaire et l’organogénèse. Des pousses adventives peuvent être…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous sommes reconnaissants à M. Akira Murakami, du département de Biosciences appliquées, Université de Toyo et M. Koudai Taniguchi de l’Agricultural Technology Center de Gunma pour leur assistance technique. Nous sommes également reconnaissants au professeur Shosaku Kashiwada et Dr Uma Maheswari Rajagopalan, Université Toyo pour leurs suggestions. Cette étude a été financée en partie par le centre de recherche pour la vie et Sciences de l’environnement, l’Université Toyo.

Materials

[2H5]indole-3-acetic acid Olchemlm Ltd 031 1531 Internal standard for LC-MS/MS
[2H5]trans-zeatin Olchemlm Ltd 030 0301 Internal standard for LC-MS/MS
[2H5]trans-zeatin riboside Olchemlm Ltd 030 0311 Internal standard for LC-MS/MS
[2H6]N6-isopentenyl adenine Olchemlm Ltd 030 0161 Internal standard for LC-MS/MS
[2H6]N6-isopentenyl adenosine Olchemlm Ltd 030 0171 Internal standard for LC-MS/MS
indole-3-acetic acid Wako 098 00181 standard for LC-MS/MS
trans-zeatin SIGMA-ALDRICH Z0876 5MG standard for LC-MS/MS
trans-zeatin riboside Wako 262 01081 standard for LC-MS/MS
N6-isopentenyl adenine SIGMA-ALDRICH D7674 1G standard for LC-MS/MS
N6-isopentenyl adenosine ACROS ORGANICS 22648 1000 standard for LC-MS/MS
acetonitrile hypergrade for LC-MS LiChrosolv MERCK 1.00029.1000 solvent for LC-MS/MS
Water for chromatography LiChrosolv MERCK 1.15333.1000 solvent for LC-MS/MS
HPLC SHIMADZU Prominence
MS Sciex 3200QTRAP
Oasis HLB 30 mg/1 cc Waters WAT094225 cartridge column
Oasis MCX 30 mg/1 cc Waters 186000252 cartridge column
screw neck total recovery vial Waters 186002805
blue, 12 x 32mm screw neck cap and PTFE/silicone septum Waters 186000274
Acquity UPLC BEH C18, 2.1×100 mm Waters 186002350 UPLC column
Proshell 120 EC-C18, 2.1×50 mm Agilent 699775-902 UPLC column
Digital microscope Leica DHS1000
TissueLyser II QIAGEN 85300
Surgical blade Feather No. 22
Scalpel handle Feather No. 4
Savant SpeedVac/Refregerated vapor trap Thermo Fisher Scientific SPD111/RVT4104 vacuum concentrartor
Disposable glass tobe (13×100 mm) IWAKI 9832-1310
Sterile petri dish INA OPTICA I-90-20

References

  1. Haberlandt, G. Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitzungsber. Math.-Naturwiss. Kl. Akad. Wiss. Wien. 111, 69-92 (1902).
  2. Skoog, F., Miller, C. O. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. Symp Soc Exp Biol. 11, 118-130 (1957).
  3. Ganeshan, S., Caswell, K. L., Kartha, K. K., Chibbar, R. N., Khachatourians, G. G., McHughen, A., Scorza, R., Nip, W. K. . Transgenic plants and crops. , 69-84 (2002).
  4. Teshima, D., Ikeda, K., Satake, M., Aoyama, T., Shimomura, K. Production of emetic alkaloid by in vitro culture of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 278-280 (1988).
  5. Chatterjee, S. K., Nandi, R. P., Ghosh, N. C., Atal, C. K., Kapur, B. M. Cultivation and utilixzation of medicinal plants. Regional Research Laboratory, Council of Scientific and Industrial Research. , 295-301 (1982).
  6. Yoshimatsu, K., Shimomura, K., Bajaj, Y. P. S. . Biotechnology in Agriculture and Forestry 21, Medicinal and Aromatic Plants IV. , 87-103 (1993).
  7. Ideda, K., Teshima, D., Aoyama, T., Satake, M., Shimomura, K. Clonal propagation of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 288-291 (1988).
  8. Yoshimatsu, K., Shimomura, K. Efficient shoot formation on internodal segments and alkaloid formation in the regenerates of Cephaelis ipecacuanha A. Richard. Plant Cell Rep. 9 (10), 567-570 (1991).
  9. Koike, I., Taniguchi, K., Shimomura, K., Umehara, M. Dynamics of endogenous indole-3-acetic acid and cytokinins during adventitious shoot formation in ipecac. J. Plant Growth Regul. , (2017).
  10. Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50 (1), 151-158 (1968).
  11. Watad, A. A., et al. Adventitious shoot formation from carnation stem segments: a comparison of different culture procedures. Scientia Hortic. 65 (4), 313-320 (1996).
  12. Ajithkumar, D., Seeni, S. Rapid clonal multiplication through in vitro axillary shoot proliferation of Aegle marmelos (L.) Corr., a medicinal tree. Plant Cell Rep. 17 (5), 422-426 (1998).
  13. Tiwari, V., Tiwari, K. N., Singh, B. D. Comparative studies of cytokinins on in vitro propagation of Bacopa monniera. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 66 (1), 9-16 (2001).
  14. Rao, M. S., Purohit, S. D. In vitro shoot bud differentiation and plantlet regeneration in Celastrus paniculatus Willd. Biol. Plant. 50 (4), 501-506 (2006).
  15. Sanikhani, M., Frello, S., Serek, M. TDZ induces shoot regeneration in various Kalanchoë blossfeldiana Poelln cultivars in the absence of auxin. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 85 (1), 75-82 (2006).
  16. Yoshimoto, K., et al. Autophagy negatively regulates cell death by controlling NPR1-dependent salicylic acid signaling during senescence and the innate immune response in Arabidopsis. Plant Cell. 21 (9), 2914-2927 (2009).
  17. Schaller, G. E., Bishopp, A., Kieber, J. J. The yin-yang of hormones: cytokinin and auxin interactions in plant development. Plant Cell. 27 (1), 44-63 (2015).

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Cite This Article
Koike, I., Shimomura, K., Umehara, M. Quantification of Endogenous Auxin and Cytokinin During Internode Culture of Ipecac. J. Vis. Exp. (133), e56902, doi:10.3791/56902 (2018).

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