Biz gazeteci enzim floresan (REF) kullanarak Mycobacterium tüberküloz ile (M. tuberculosis) enfekte farelerin optik görüntüleme açıklar. Bu iletişim kuralı M. tuberculosis hassas ve belirli algılama Patogenez, tedavi ve aşı araştırma için önceden klinik hayvan modellerinde kolaylaştırır.
Muhabir enzim floresan (REF) için mevcut faiz hedef organizmalarda yansıması oluşturma veya floresan veya bioluminescence tarafından algılamayı enzimler belirli yüzeylerde kullanır. Biz BlaC, yapısal tüm M. tuberculosis suşlarının tarafından ifade edilen bir enzim kullanmaktadır. REF bakterilerin akciğerlerde virüslü fareleri hızlı miktar sağlar. Fareler aynı grup büyük ölçüde maliyetlerini azaltarak, bakteri daha hızlı numaralandırma, roman gözlemler ana bilgisayar-patojen etkileşimlerde izin ve istatistiksel güç, grup başına daha fazla hayvan kolayca korunur bu yana artan birçok zaman noktalarda, yansıma . REF son derece hassas BlaC enzimatik muhabir katalitik doğası gereği ve belirli özel flourescence rezonans enerji transferi (FRET) veya fluorogenic yüzeylerde kullanılan nedeniyle. REF rekombinant suşları, normal ev sahibi-patojen etkileşimleri sağlanması gerektirmez. M. tuberculosis enfeksiyonu ile 800 maksimal emisyon FRET substrat kullanarak görüntüleme tarif nm. Dalga boyu substrat memelilerde hassas derin doku görüntüleme sağlar. M. tuberculosis, anestezi farelerin, REF substrat ve optik görüntüleme yönetimi ile fareler aerosol enfeksiyon açıklayacağım. Bu yöntem, ana bilgisayar-patojen etkileşimleri ve M. tuberculosishedefleme antibiyotiklerin etkinliğini değerlendirmek için başarıyla uygulandı.
M. tuberculosis yavaş büyüme oranı büyük bir barikat tüberküloz1,2,3hızlı tanı olduğunu. Tanı sonuçları üretmek için hafta sürer kültür dayalı iken, acid-fast smear tanılama sınırlamalar4 çocuklar5 ve insan immün yetmezlik virüsü6,7ile koenfekte Hastalar vardır. Optik görüntüleme teknolojileri son zamanlarda geleneksel tanı yöntemleri tüberküloz8,9için alternatif olarak kabul edilmiştir. Floresan ve bioluminescence optik, gerçek zamanlı10,–11,12,13,14Canlı hayvanlarda M. tuberculosis görüntü için kullanılabilir, 15,16,17,18,19. Optik görüntüleme bir enfeksiyon M. tuberculosis20,21,22ile hızlı ve spesifik bir değerlendirmenin yararı vardır.
M. tuberculosis optik görüntüleme ürün kodu kullanarak canlı farelerde ayrıntılarını anahat. Bu yöntem çok özel ve hassas23,24 ve, daha az görme duyusuyla ilgili diğer yöntemlere benzer diğer yöntemler tüberküloz (TB)25Bilgisayarlı Tomografi (CT)26, manyetik dahil olmak üzere, görüntüleme daha pahalı rezonans görüntüleme (MRG)27ve F-florodeoksiglikoz Pozitron emisyon tomografi/CT (F-FDG PET/BT)28. REF bir floresan ürün8,29üreten bir bakteriyel enzim tarafından bölünme üzerine özel floresan veya kollarındaki yüzeylerde kullanır. Bu nedenle, bir rekombinant Mikobakteriyel muhabir zorlanma30,31gerektirmeyen bir avantaja sahiptir. Açıklanan FRET substrat, bir fluorochrome ve BlaC (β-lactamase), doğal olarak yapısal Tüberküloz Kompleks Mycobacterium8tarafından, ifade tarafından hidrolize bir β-laktam halkası ile bağlı bir içki oluşur 32. bakteri doğrudan sinyal nedeniyle birçok büyüklük ve hassas M. tuberculosistespiti tarafından amplifikasyon sağlar REF katalitik aktivitesi oluşturmak.
Bu çalışmada kullanılan REF substrat canlı hayvan mükemmel doku penetrasyonu vardır ve arka plan nedeniyle, uzun dalga boyu düşük. Bu uzun dalga boyu substrat ile yaklaşık 100 M. tuberculosis için algılama eşik ulaşmak mümkündür birimleri (CFU) vitro oluşturan colony ve < 1000 CFU fareler vivo içinde (bütün hayvan)8, akciğerlerde 33. REF bir tanı aracı balgam, klinik malzemeler için ve hatta doğrudan onun yüksek duyarlılık ve özgüllük nedeniyle mikro endoskopik sistemleri16,32,33,34 olan hastalarda kullanılabilir. Tüm suşların mevcut algılama için doğal olarak üretilen bakteriyel enzim, BlaC, kullandığı için REF herhangi bir tüberküloz klinik zorlanma için uygulanabilir. Bu özellikleri önceden klinik tüberküloz araştırmasında değerli bir araç genel olarak tedavi kolaylaştırmak için Imaging REF ve aşı değerlendirme aynı zamanda Patogenez analizini yapmak, ama da sonuçta tüberküloz tanısında uygulanabilir hastalar.
Hakem gibi görüntüleme teknikleri kullanırken üretimi, sağlam ve tutarlı veriler izin anahtar stratejiler vardır. Optik görüntüleme her yöne yayılan ışık yakalamak zor olduğundan hangi penetrasyon, derinliği etkileyebilir dokularda dağınık ışık üretir. Kullanım bir yakın kızıl ötesi fluorophore (Nur) substrat 700-900 nm Querange içinde bir uyarma ve emisyon dalga boyuna sahip Imaging REF için floresan sinyal minimal absorpsiyonu memeli dokular ile kolaylaştırır. Özel tasarlanmış substrat bir nur fluorophore, IRDye 800Cw bir içki için bağlama tarafından inşa edilmiş IRDye QC-1, Floresans rezonans enerji transferi tabanlı Şoklama izin laktam halkası. IRDye mükemmel doku penetrasyonu ve özellikleri saçılma ışık ve memeliler36üzerinde belirgin herhangi bir zararlı etkisi yok, kan ve organları oluşmuş 24 h floresan işaretli sinyal önemli ölçüde artar 4 h sonra başlayan substrat yönetim, maksimal ulaşan 6 h sonra Yönetim düzeyleri.
Bakteriyel enfeksiyon doz, bulaşıcı doz ve substrat İdaresi hem de zaman-mesaj enfeksiyon pilot çalışmalar gerçekleştirerek Imaging Puan şekli üzerinde büyük, karmaşık, deney başlamadan önce standart. Pilot çalışmalar büyük ölçüde zaman ve maliyet Standart bir prosedür anahtar deney yaparken önce optimize edilebilir çünkü çok sayıda hayvan Imaging küçültebilirsiniz. Bakteriyel yükler ve organ/dokularda tüm vücut görüntülemesi trans-aydınlatma ve ex vivo akciğer görüntüleme sinyalin kaynağını doğrulamak ve korelasyon kalitesini belirlemek için epi-aydınlatma kullanarak kullanarak aşağıdaki ilgi tespit edilmelidir Bakteriyel numaraları ile mevcut8. Pilot çalışmalar algılama eşiğinin, dinamik alan tekniği yanı sıra görüntüleme için en iyi deneysel koşullar belirlenmesi görmemizi sağlar.
Birincil olarak Imaging REF kullanmanın avantajları diğer floresan ve kollarındaki stratejileri için karşılaştırılır, yüksek hassasiyet ve doğal M. tuberculosis resim yeteneği suşları. Imaging REF catalytically sağlam enzim tüm M. tuberculosis klinik yalıtır ve Tüberküloz Kompleks suşları korunmuş BlaC kullanır. Imaging REF büyük duyarlılık hızlı katalitik oranı BlaC birlikte ile saklama cleaved floresan ürünün ana hücre kaynaklanmaktadır. Belgili tanımlık substrate enfekte hücreleri ve doku içinde sinyal neredeyse sınırsız birikmesi debisi olduğu sürece sürekli artar sinyal. Imaging REF artan bu duyarlılığını görüntüleme alternatif yaklaşımlar için karşılaştırıldığında M. tuberculosis belirli algılama her iki vitro sağlar ve in vivo8,23,24, 29.
Imaging REF-ebilmek var olmak kullanılmış için bakteriyel algılama genetik değişiklik herhangi bir enfeksiyon, her iki laboratuvar hayvanları8,37 veya insan klinik malzeme29,38 için doğrudan uygulama etkinleştirme olmadan . REF algılayıp fluorogenic yüzeylerde proteaz, kinaz, ureases ve β-galactosidases gibi BlaC dışında birçok enzimatik hedefleri için geliştirilen bu yana patojenler39,40, geniş bir dizi görüntü için kullanılabilir. Ancak, dikkatli düşünce emin olmak için hedefe verilmesi gerektiğini bu görüntüleme için en uygun özellikleri görüntüler. BlaC iyi model enzim bu stratejinin başarılı uygulama sağlayacak özellikleri için temsil eder. Imaging REF hemen bir eşleştirmeyi bakteri yükü akciğerlerde mevcut enfeksiyonlar sırasında ilerleme çalışmada, tüberküloz Patogenez, bakteriyel numaraları belirlenmesi normalde üç ila altı hafta gerektirdiğinden, fakat bile daha büyük ölçüde hızlandıran sağlar Bu yaklaşım çok şey kazandıracak hızlı büyüyen organizmalar zaman. REF tüberküloz, hastaların41,42Nodüler lezyonlar tanısında önemli bir sorun gelen karsinomlar ayırımcılık için de kullanılabilir. REF translasyonel tüberküloz görüntüleme hızlandırmak için yeni bir araç olarak hizmet vermektedir ve hatta potansiyel olarak tedavi edici sonuçlar hızlı tahmin izin insanlar için uygulanabilir.
Isoflurane | VETONE | 501027 | |
CNIR800 | Custom synthesized | ||
Fatal Plus solution | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | ||
7H9 Middlebrook broth | BD | 271310 | |
OADC Middlebrook enrichment | BD | 212351 | |
Sporcidin | RE-1284F | ||
7H11 Middlebrook Agar | BD | 212203 | |
Madison Chamber | |||
IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | |
XGI-8-gas Anesthesia System | Perkin Elmer | ||
Living Imaging software | Perkin Elmer | ||
Transparent nose cones | Perkin Elmer | ||
M. tuberculosis strain CDC1551 | ATCC | ||
Female BALB/C mice, 5-7 weeks | Jackson Laboratory |