Descrevemos a imagem óptica de camundongos infectados com Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) usando fluorescência de enzima repórter (REF). Esse protocolo proporciona uma detecção sensível e específica de M. tuberculosis em modelos animais pré-clínicos para investigação patogenia, terapêutica e vacina.
Fluorescência de enzima repórter (REF) utiliza substratos específicos para enzimas presentes em organismos alvo de interesse para a imagem latente ou detecção por fluorescência ou bioluminescência. Nós utilizamos BlaC, uma enzima constitutivamente expressada por todas as cepas de M. tuberculosis . REF permite rápida quantificação de bactérias nos pulmões de ratos infectados. O mesmo grupo de ratos pode ser fotografado em muitos pontos do tempo, extremamente reduzindo custos, enumerando as bactérias mais rapidamente, permitindo que novas observações em interações patógeno-hospedeiro e aumentar o poder estatístico, desde que mais animais de cada grupo são facilmente mantidos . REF é extremamente sensível devido à natureza catalítica do repórter enzimática BlaC e específicas devido à transferência de energia de ressonância de flourescence personalizado (FRET) ou fluorogenic carcaças usadas. REF não requer cepas recombinantes, garantindo interações patógeno-hospedeiro normal. Descrevemos a imagem latente da infecção por M. tuberculosis utilizando um substrato de traste com emissão máxima em 800 nm. O comprimento de onda do substrato permite que a imagem sensível tecido profundo em mamíferos. Nós irá delinear a infecção de aerossol de ratos com M. tuberculosis, anestesia de ratos, a administração do substrato REF e óptico de imagem. Este método tem sido aplicado com sucesso para avaliar interações patógeno-hospedeiro e a eficácia dos antibióticos visando o M. tuberculosis.
A taxa de crescimento lento de M. tuberculosis é um obstáculo importante no diagnóstico rápido da tuberculose1,2,3. Enquanto a cultura com base em diagnóstico leva semanas para produzir resultados, esfregaço ácido-álcool resistentes tem limitações de diagnóstico4 em crianças de5 e pacientes co infectados com o vírus da imunodeficiência humana6,7. Tecnologias de imagem ópticas têm sido reconhecidas recentemente como uma alternativa aos tradicionais métodos de diagnóstico para tuberculose8,9. Fluorescência e bioluminescência podem ser usados para a imagem opticamente M. tuberculosis em animais vivos em tempo real10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19. Imagem latente ótica tem o benefício de uma avaliação rápida e específica de uma infecção com M. tuberculosis20,21,22.
Nós esboçamos detalhes para a imagem latente ótica de M. tuberculosis em ratos ao vivo usando REF. Este método é muito específico e sensível23,24 e, semelhante a outros métodos ópticos, é menos caro do que outros métodos de tuberculose (TB) de imagem25, incluindo tomografia computadorizada (CT)26, magnético ressonância de imagem (MRI)27e F-fluorodeoxyglucose a tomografia por emissão de pósitrons/CT (F-FDG PET-CT)28. REF utiliza personalizados substratos fluorescentes ou bioluminescentes que após clivagem por uma enzima bacteriana, produzir um produto fluorescente8,29. Portanto, tem a vantagem de não exigir uma estirpe de recombinantes repórter micobacteriana30,31. O substrato FRET descrito é composto por um fluorocromo e um quencher conectado por um anel β-lactâmico que é hidrolisado pela BlaC (β-lactamases), naturalmente constitutivamente expressado por tuberculose-complexo Mycobacterium8, 32. as bactérias diretamente geram sinal devido à atividade catalítica de REF que permite a amplificação por muitas ordens de magnitude e detecção sensível de M. tuberculosis.
O substrato REF utilizado neste estudo tem tecido excelente penetração em animais vivos e reduzido fundo devido ao seu longo comprimento de onda. Com esse substrato de longo comprimento de onda é possível alcançar um limite de detecção para M. tuberculosis de quase 100 formadoras de unidades (CFU) em vitro e < 1000 CFU nos pulmões de ratos na vivo (todo animal)8, 33. REF pode ser usado como uma ferramenta de diagnóstico para expectoração, materiais clínicos e até mesmo diretamente em pacientes com micro sistemas endoscópica16,32,33,34 devido a sua alta sensibilidade e especificidade. REF pode ser aplicado a qualquer tensão clínica de tuberculose, porque usa uma enzima bacteriana produzida naturalmente, BlaC, para a deteção presente em todas as estirpes. Estas características fazem REF imagem uma ferramenta valiosa na pesquisa pré-clínica tuberculose em geral para facilitar a terapêutica e avaliação de vacinas, bem como a análise de patogênese, mas também, em última análise, podem ser aplicadas ao diagnóstico de tuberculose pacientes.
Ao usar técnicas de imagem, tais como REF, existem estratégias-chave que permitem a geração de dados robustas e consistentes. Imagem latente ótica produz luz espalhada em tecidos que podem afetar a profundidade de penetração, uma vez que é difícil de captar a luz emitida em todas as direções. Uso de um fluoróforo de infravermelho próximo (NIR) substrato para REF tendo um comprimento de onda de excitação e emissão no Querange de 700-900 nm de imagem facilita a absorção mínima do sinal fluorescente por tecidos de mamíferos. O substrato personalizado projetado foi construído, ligando um fluoróforo NIR, IRDye 800Cw para um quencher, QC IRDye-1, por um anel lactâmico permitindo fluorescência ressonância energética baseada em transferência têmpera. IRDye tem penetração de tecido excelente e características de dispersão de luz e não tem qualquer efeito prejudicial evidente mamíferos36, sendo liberado do sangue e órgãos por 24 h. fluorescência sinal significativamente aumenta começando 4 h após Administração de substrato, atingir o máximo níveis 6 h após a administração.
A dose infecciosa bacteriana, modo de administração da dose infecciosa e o substrato, bem como os pontos de tempo de imagem post infecção através da realização de estudos-piloto deve ser padronizada antes de embarcar em grandes e complexas, experiências. Estudos-piloto podem reduzir tempo e custo quando a imagem de um grande número de animais porque um procedimento padrão pode ser otimizado antes de fazer o experimento chave. Cargas bacterianas devem ser determinadas nos órgãos/tecidos de interesse, seguindo a imagem de corpo inteiro usando trans-iluminação e ex vivo pulmão imagem usando epi-iluminação para validar a fonte do sinal e determinar a qualidade da correlação com números bacteriana presente8. Estudos-piloto irão fornecer insights sobre o limiar da deteção, gama dinâmica da técnica, bem como a determinação das condições experimentais ideais para a imagem latente.
As principais vantagens de usar REF imagem como em comparação com outras estratégias de fluorescentes e bioluminescentes são sua alta sensibilidade e capacidade de imagem natural M. tuberculosis estirpes. REF de imagem utiliza a enzima cataliticamente robusta BlaC que é conservada em todos os isolados clínicos de M. tuberculosis e cepas de tuberculose-complexo. A grande sensibilidade de REF de imagem é devido à rápida taxa catalítica de BlaC em combinação com a retenção do produto fluorescente clivada pela célula hospedeira. O sinal continuamente aumenta enquanto o substrato está disponível, resultando em acúmulo quase ilimitado do sinal dentro da células infectadas e tecidos. Este aumento da sensibilidade de REF de imagem em comparação com abordagens alternativas de imagem permite a detecção específica de M. tuberculosis ambos em vitro e em vivo8,23,24, 29.
REF de imagem pode ser usado para a deteção bacteriana sem modificações genéticas, permitindo sua aplicação direta para qualquer modelo de infecção, de qualquer laboratório animais8,37 ou materiais clínicos humanos29,38 . REF pode ser usado para detectar e imagem de uma grande variedade de patógenos39,40, desde fluorogenic carcaças podem ser desenvolvidas para inúmeros alvos enzimáticos diferente BlaC como proteases, quinases, ureases e β-galactosidases. No entanto, cuidado pensamento deve ser dada ao alvo para garantir ele exibe as características ideais para a imagem latente. BlaC representa uma enzima bom modelo para características que garantam a aplicação bem sucedida desta estratégia. REF de imagem fornece uma leitura imediata na carga bacteriana presente nos pulmões durante infecções, que se apressa muito progresso no estudo da patogênese da tuberculose, uma vez que a determinação dos números bacterianas normalmente requer três a seis semanas, mas mesmo no mais organismos de crescimento rápido esta abordagem vai poupar uma grande quantidade de tempo. REF também pode ser usado para discriminar carcinomas de tuberculose, dos principais problemas no diagnóstico de lesões nodulares em pacientes41,42. REF serve como uma nova ferramenta para acelerar a imagem latente de tuberculose translacional e pode ser aplicada aos seres humanos, potencialmente permitindo rápida predição dos resultados terapêuticos.
Isoflurane | VETONE | 501027 | |
CNIR800 | Custom synthesized | ||
Fatal Plus solution | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | ||
7H9 Middlebrook broth | BD | 271310 | |
OADC Middlebrook enrichment | BD | 212351 | |
Sporcidin | RE-1284F | ||
7H11 Middlebrook Agar | BD | 212203 | |
Madison Chamber | |||
IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | |
XGI-8-gas Anesthesia System | Perkin Elmer | ||
Living Imaging software | Perkin Elmer | ||
Transparent nose cones | Perkin Elmer | ||
M. tuberculosis strain CDC1551 | ATCC | ||
Female BALB/C mice, 5-7 weeks | Jackson Laboratory |