我们描述了使用报告酶荧光 (REF) 感染结核分枝杆菌(m 结核) 的小鼠的光学成像。该协议有助于在临床前动物模型中对m. 结核进行敏感和特定的检测, 以进行发病机制、治疗和疫苗研究。
报告酶荧光 (REF) 利用的基底, 是特定的酶存在于目标有机体的成像或检测的荧光或生物发光。我们利用拉丁, 一种由所有结核组成性菌株表达的酶。REF 允许快速定量的细菌在肺部感染的小鼠。同一组小鼠可以在许多时间点成像, 大大降低成本, 更快地列举细菌, 允许在寄主-病原体相互作用方面的新的观察, 增加统计能力, 因为每组更多的动物易于维护.由于自定义荧光共振能量转移 (拉丁) 或荧光基板使用, REF 是非常敏感的由于催化性质的酶记者和具体的。REF 不需要重组菌株, 以确保正常宿主病原体相互作用。我们描述了m. 结核感染的影像, 使用的是最大排放量为 800 nm 的烦恼基底。基底的波长允许哺乳动物敏感的深部组织成像。我们将概述小鼠的气溶胶感染的m. 结核, 麻醉小鼠, 参考基质的管理和光学成像。这种方法已成功地应用于评估宿主-病原体相互作用和抗生素对靶向结核治疗的效果。
m. 结核的缓慢增长率是结核病快速诊断的一个主要障碍1,2,3。虽然基于区域性的诊断需要几周的时间才能产生结果, 但酸性快速涂片在儿童5中有诊断限制4 , 患者与人体免疫机能丧失病毒6,7有共同感染。光学成像技术最近被认为是替代传统的结核病诊断方法8,9。荧光和生物发光可用于实时10,11,12,13,14的活体动物中的光学图像m. 结核, 15,16,17,18,19。光学成像有助于快速而具体地评估感染与m. 结核20,21,22。
我们概述了使用 REF 对活鼠中的m. 结核进行光学成像的细节。此方法非常特定且敏感23、24 , 与其他光学方法类似, 比其他结核病 (TB) 成像25的方法成本低, 包括计算机断层扫描 (CT)26, 磁性磁共振成像 (MRI)27和 F 氟脱氧葡萄糖正电子发射断层扫描/ct (f-葡萄糖 PET/ct)28。REF 利用自定义的荧光或生物发光基底, 经细菌酶解裂后, 产生荧光产物8,29。因此, 它的优点是不需要重组结核杆菌报告器应变30,31。所述的烦恼基板由由拉丁 (β酶) 水解的β-内酰胺环连接的 fluorochrome 和淬火组成, 自然组成性由结核复合分枝杆菌 8,32. 细菌直接产生的信号, 由于 REF 催化活动, 允许放大的数量级和敏感检测的m. 结核。
本研究所用的 REF 基底在活体动物中具有良好的组织穿透力, 并且由于波长长而减少了背景。有了这个长波长的基底, 就有可能在小鼠 (整个动物)8中, 为近100个菌落形成单位 (CFU)体外和 < 1000 CFU 的m. 结核检测阈值. 33。REF 可作为一个诊断工具的痰, 临床材料, 甚至直接在微内窥镜系统的患者16,32,33,34由于其高灵敏度和特异性。REF 可以应用于任何结核病临床菌株, 因为它使用天然产生的细菌酶, 拉丁, 用于检测目前在所有菌株。这些特点使 REF 成像在临床前结核病研究中具有重要的应用价值, 有助于治疗和疫苗的评估以及发病机制的分析, 但最终也可应用于结核病的诊断。患者.
当使用像 REF 这样的成像技术时, 有一些关键策略允许生成健壮和一致的数据。光学成像在组织中产生散射光, 这会影响穿透深度, 因为很难捕捉到所有方向发出的光。利用近红外线荧光 (近红外) 基质进行 REF 成像, 在 Querange 中具有激发和发射波长的 700-900 nm, 有利于哺乳动物组织对荧光信号的最小吸收。定制设计的基底是通过将近红外荧光, IRDye 800Cw 到淬火, IRDye QC-1, 通过一个内酰胺环, 允许荧光共振能量转移为基础的淬火构造。IRDye 具有良好的组织穿透和光散射特性, 对哺乳动物没有任何明显的有害影响36, 从血液和器官清除 24 h. 荧光信号显著增加起始4小时后基板管理, 达到最高水平后6小时管理。
在开展大型、复杂的实验前, 应规范细菌感染剂量、感染剂量的管理方式、基质以及影像后感染的时间点。试验性研究可以大大减少成像大量动物的时间和成本, 因为一个标准程序可以优化之前进行的关键实验。细菌负荷应确定的器官/组织的整个身体成像后, 使用反光照和体外肺成像, 利用 epi 照明来验证信号的来源和确定相关的质量与细菌数字存在8。试点研究将提供洞察的阈值检测, 动态范围的技术, 以及确定的最佳实验条件的成像。
与其他荧光和发光策略相比, 使用 REF 成像的主要优点是它具有较高的灵敏度和对自然的m. 结核菌株的成像能力。REF 成像利用催化健壮的酶拉丁, 保存在所有的m. 结核临床分离株和结核复杂菌株。由于拉丁的快速催化速率和宿主细胞对荧光产物的保留, 导致了 REF 成像的极大灵敏度。只要基底可用, 信号就会不断增加, 从而使感染细胞和组织内的信号几乎无限地积聚。与其他成像方法相比, 此提高了 REF 成像的灵敏度, 允许对m. 结核进行特定检测体外和在体内8,23,24, 29。
REF 成像可用于细菌检测, 没有基因修改, 使其直接应用到任何感染模型, 实验动物8,37或人体临床资料29,38.REF 可用于检测和图像范围广泛的病原体39,40, 因为荧光基板可以开发为许多酶的目标以外的拉丁, 如蛋白酶, 激酶, ureases 和β galactosidases。但是, 应仔细考虑目标, 以确保其显示最佳特征的成像。拉丁代表一个良好的模型酶的特点, 将确保成功地应用这一战略。REF 成像提供了一个即时读取的细菌负荷在肺部感染期间, 这大大加快了研究结核病发病机制, 因为细菌数量的测定通常需要三周到六星期, 但即使在更快速生长的生物体这种方法将节省大量的时间。参考文献也可用于鉴别癌症的结核病, 一个关键问题诊断的结节性病变的患者41,42。REF 作为一种新的工具, 以加速翻译结核成像, 甚至可以应用于人类, 可能允许快速预测的治疗结果。
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