결핵균 (M. 결핵) 기자 효소 형광 (REF)를 사용 하 여 감염 된 쥐의 광학 이미징을 설명 합니다. 이 프로토콜 pathogenesis, 치료 및 백신 연구에 대 한 전 임상 동물 모델에 M. 결핵 의 과민 하 고 특정 탐지를 촉진 한다.
기자 효소 형광 (REF) 효소 이미징 또는 형광 또는 생물 발광에 의해 감지에 대 한 관심의 대상 생물에 존재에 대 한 관련 된 기질을 활용 합니다. 우리는 BlaC, constitutively 모든 M. 결핵 종자로 표현 하는 효소를 이용 한다. REF는 감염 된 쥐의 폐에 있는 박테리아의 급속 한 정량화를 허용 한다. 쥐의 동일한 그룹 많은 시간 포인트, 크게 비용 절감, 보다 신속 하 게 박테리아를 열거, 호스트 병원 체 상호 작용에 비 발한 관측을 허용 하 고 통계적 인 힘을 증가 하는 그룹 당 더 많은 동물을 쉽게 유지 됩니다 때문에 몇 군데 있습니다. . REF는 매우 BlaC 효소 기자의 촉매 특성으로 인해 과민 하 고 특정 사용자 지정 flourescence 공명 에너지 전달 (무서 워) 또는 fluorogenic 기판 사용. REF 필요 하지 않습니다 재조합 종자, 일반 호스트 병원 체 상호 작용을 보장. 800에서 최대한 방출 무서 워 기판 사용 M. 결핵 감염의 영상 설명 nm. 기판의 파장 포유동물에 중요 한 깊은 조직 이미지를 수 있습니다. 우리는 어로 졸 감염 M. 결핵, 쥐의 마 취, REF 기판, 광학 이미징의 관리와 쥐의 개요 것입니다. 이 방법은 호스트 병원 체 상호 작용 및 M. 결핵를 대상으로 하는 항생제의 효능 평가를 성공적으로 적용 되었습니다.
M. 결핵 의 느린 성장 속도 결핵1,2,3의 신속한 진단에 주요 장애물입니다. 문화 기반 진단 소요 주 결과를, 반면 acid-fast 얼룩은 어린이5 와 인간 면역 결핍 바이러스6,7공동 감염 환자에서 진단 제한4 . 광학 이미징 기술은 최근 결핵8,9를 위한 전통적인 진단 방법의 대 안으로 인정 되었습니다. 형광 및 생물 발광 광학 실시간10,11,12,,1314, 살아있는 동물에 M. 결핵 의 이미지를 사용할 수 있습니다. 15,,1617,,1819. 광학 이미징 M. 결핵20,,2122감염의 신속 하 고 구체적인 평가의 이점이 있습니다.
우리는 REF를 사용 하 여 라이브 쥐에 M. 결핵 의 광학 이미징에 대 한 세부 정보를 설명 합니다. 이 방법은 매우 구체적이 고 민감한23,24 이며, 다른 광학 방법에 유사한 적은 결핵 (TB) 이미징25, 단층 촬영 (CT)26, 자석 등의 다른 방법 보다 비싼 공명 영상 (MRI)27, 그리고 F-fluorodeoxyglucose 양전자 방출 단층 촬영/CT (F FDG PET/CT)28. REF 세균성 효소에 의해 쪼개 짐에 따라 형광 제품8,29를 생산 하는 사용자 지정 형광 또는 발광 기질을 활용 합니다. 따라서, 재조합 mycobacterial 기자 스트레인30,31를 요구 하지 않기의 이점이 있다. 설명 무서 워 기판은는 형광 색소와 끄는 BlaC (β-lactamase), 자연스럽 게 결핵-복잡 한 진 균8, constitutively 표현에 의해 분해 되는 β 락탐 반지에 의해 연결 된로 구성 32. 박테리아는 직접 많은 크기 순서와 M. 결핵의 민감한 감지에 의해 증폭 수 REF 촉매 활동으로 인해 신호를 생성.
이 연구에 사용 된 REF 기판 생체에 우수한 조직 침투 있으며 감소의 긴 파장 때문에 배경. 이 긴 파장 기판으로 그것은 거의 100의 M. 결핵 에 대 한 탐지의 문 턱을 달성 하는 것 콜로 니 형성 단위 (CFU) 생체 외에서 그리고 < 쥐 vivo에서 (전체 동물)8, 폐에서 1000 CFU 33. REF가 래, 임상 자료와 환자 마이크로 내 시경 시스템16,32,,3334 그것의 높은 감도 및 특이성 때문에 직접 진단 도구로 사용할 수 있습니다. REF는 BlaC, 자연스럽 게 생산된 세균 효소를 사용 하 여 검색 모든 긴장에 때문에 어떤 결핵 임상 스트레인에 적용할 수 있습니다. 이러한 특성 pathogenesis의 분석 뿐만 아니라 REF 일반적 치료 촉진 하기 전 임상 결핵 연구에 유용한 도구를 이미징 및 백신 평가 하지만 또한 궁극적으로 결핵 진단에 적용할 수 있습니다. 환자입니다.
REF, 같은 이미징 기술을 사용 하 여 강력 하 고 일관 된 데이터의 생성을 허용 하는 주요 전략 있습니다. 광학 이미징 이후 모든 방향으로 방출 하는 빛을 포착 하기 어려운, 침투의 깊이 영향을 줄 수 있는 조직에 흩어져 빛을 생성 합니다. 사용 근처 적외선 fluorophore (NIR)의 REF 700-900 nm의 Querange에 여기 및 방출 하는 파장을 갖는 이미징에 대 한 기판 포유류 조직에 의해 형광 신호의 최소한의 흡수를 용이 하 게 한다. 사용자 정의 설계 기판 NIR fluorophore, IRDye 800Cw를 끄는에 연결 하 여 건설 되었다 IRDye QC-1, 형광 공명 에너지 전송 기반 냉각 허용 락탐 반지에 의해. IRDye 우수한 조직 침투는 빛 산란 특성 및 포유류36에 분명 어떤 유해한 효과 없습니다, 24 h 형광 혈액과 기관에서 허가 되 고 신호 크게 증가 시작 후 4 h 기판 관리, 관리 후 6 h 레벨 최대에 도달.
세균 감염 복용량, 감염 복용량과 기판의 관리 시간 게시물 감염 파일럿 연구를 수행 하 여 이미징의 포인트의 모드는 크고, 복잡 한, 실험에 착수 하기 전에 표준화 되어야 한다. 파일럿 연구 크게 줄일 수 시간 및 비용 표준 절차 주요 실험 하 고 이전에 최적화 될 수 있기 때문에 동물의 많은 수를 이미징 하는 경우. 세균 중 관심 몸 전체 이미징 트랜스 조명과 epi 조명 신호 소스를 확인 하 고 상관 관계의 품질을 결정을 사용 하 여 폐 이미징 비보 전 을 사용 하 여 다음의 기관/조직에 결정 되어야 한다 박테리아와 함께 현재8번호. 파일럿 연구는 탐지의 문 턱, 기술의 동적 범위 이미징에 대 한 최적의 실험 조건의 결정에 대 한 통찰력을 제공할 것입니다.
그것의 높은 감도 자연 M. 결핵 을 이미지 하는 능력으로 이미징 REF를 사용 하 여의 주요 장점은 다른 형광 및 발광 전략에 비해 긴장. REF 이미징 모든 M. 결핵 임상 격리 및 결핵-복잡 한 긴장에 보존 BlaC 촉매로 강력한 효소를 사용 합니다. REF 이미징의 큰 감도 촉매 그만큼 BlaC의 조합에 주인 세포에 의해 쪼개진된 형광 제품의 유지와 함께 예정 이다. 신호 지속적으로 증가 기판은 결과 감염 된 세포와 조직 내에서 신호의 거의 무한 한 빌드에 사용할 수 있습니다. 이미징 REF의이 증가 된 감도 이미징의 다른 방법에 비해 두 시험관에 M. 결핵 의 특정 검색 허용 한다 vivo에서8,,2324, 29.
REF 이미징 세균 검출 감염 모델, 어느 실험실 동물8,37 또는 인간의 임상 자료29,38 의 직접 응용 프로그램을 사용 하는 유전 수정 없이 사용할 수 있습니다. . REF는 fluorogenic 기판 kinases, 프로 테아 제, β-galactosidases, ureases, 등 BlaC 이외의 수많은 효소 목표를 위해 개발 될 수 있기 때문에 다양 한 병원 체39,40, 이미지를 감지 하 사용할 수 있습니다. 그러나, 주의 생각 있도록 대상에 주어져야 한다 그것은 이미징에 대 한 최적의 특성 표시 합니다. BlaC이이 전략의 성공적인 응용 프로그램을 보장 하는 특성에 대 한 좋은 모델 효소를 나타냅니다. REF 이미징 제공 즉시 읽어 폐에 존재 하는 세균 중에 감염, 시의 결핵 병, 세균성 수의 결심은 일반적으로 3 ~ 6 주, 필요로 하기 때문에 하지만 더에 크게 진행 속도 이 이렇게 훌륭한 제의로 저장할 것 이다 급속 한 성장 하는 생물 시간. REF는 carcinomas 결핵, 결 절 성 병 변 환자41,42의 진단에 중요 한 문제에서에서 차별 또한 사용 수 있습니다. REF 가속 변환 결핵 영상 소설 도구 역할 하 고 심지어 잠재적으로 치료 결과의 빠른 예측을 허용 하는 인 간에 게 적용할 수 있습니다.
Isoflurane | VETONE | 501027 | |
CNIR800 | Custom synthesized | ||
Fatal Plus solution | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | ||
7H9 Middlebrook broth | BD | 271310 | |
OADC Middlebrook enrichment | BD | 212351 | |
Sporcidin | RE-1284F | ||
7H11 Middlebrook Agar | BD | 212203 | |
Madison Chamber | |||
IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | |
XGI-8-gas Anesthesia System | Perkin Elmer | ||
Living Imaging software | Perkin Elmer | ||
Transparent nose cones | Perkin Elmer | ||
M. tuberculosis strain CDC1551 | ATCC | ||
Female BALB/C mice, 5-7 weeks | Jackson Laboratory |