Синаптических токи могут быть записаны централизовано от визуализированных синаптической boutons на перекрестке дрозофилы третьего instar личинки нервно. Этот метод позволяет осуществлять мониторинг деятельности единого синаптических бутона.
Дрозофилы нервно-Джанкшен (NMJ) это отличная модель система изучение глутаматергические синаптической передачи. Мы опишем технику записи фокуса macropatch синаптических токов от визуализированных boutons в личиночной NMJ дрозофилы . Этот метод требует индивидуальные изготовления записи micropipettes, а также составной микроскоп с высоким увеличением, междугородной воды погружение цель, дифференциальной помехи контраст (DIC) Оптика и люминесцентные вложение. Запись электрод располагается на вершине выбранного синаптических бутона, визуализируется с DIC Оптика, epi флуоресценции или оба. Преимущество этого метода является то, что позволяет мониторинг синаптической активности ограниченное количество сайтов релиза. Запись электрод имеет диаметр несколько микрон, и выпуска сайты размещены за пределами края электродов существенно не влияет на записанные течений. Записанные синаптических течения имеют быструю кинетику и может быть легко решена. Эти преимущества особенно важны для исследования мутант летать линии с расширенной спонтанное или асинхронные синаптической активности.
Дрозофилы является система отличная модель для изучения молекулярных механизмов, контролирующих синаптической передачи. Нервно-мышечной системы у дрозофилы является глутаматергические и поэтому нервно перекрестка дрозофилы (NMJ) может использоваться для изучения функции сохранены глутаматергические выпуска. С тех пор Ян и Ян исследование1третьего возраста личинок широко используется для изучения вызвала и спонтанное синаптической передачи путем мониторинга возбуждающим Джанкшен потенциалов (EJPs) или токов (ОЕК). EJPs обычно записываются внутриклеточно резкое стекло микро-электродом, и они отражают деятельность всей NMJ, включая все boutons, делая синапсов в данной мышечные волокна.
В отличие от деятельности ограниченного числа мест выпуска может быть записан централизовано, поместив кончик микропипеткой вблизи нейрональных терминалы или синаптических варикоз. Этот метод был первоначально нанят Кац и Миледи2, и фокуса внеклеточного записи успешно применялись на несколько NMJ препараты, включая лягушка3,4,5, мыши6 , 7 , 8, ракообразное9,10,11,12,13,14,,1516и Дрозофила17,18,19,20,21,22,23. Далее этот подход был разработан Dudel, который оптимизирован перекодирование электроды24,25macropatch. В Dudel в осуществлении эта техника тесно совпадают потерять патч зажим метод26.
Дрозофилы личиночной NMJ четко определены синаптической boutons и трансгенных линий с генетически закодированный нейрональных флуоресцентные метки (см. Таблицу материалы) легко доступны. Эти преимущества позволили нам записать ОЕК и mEJCs от выбранной синаптических бутона20,21,22. Здесь мы опишем эту технику в деталях.
Дрозофилы представляет организма выгодные модели для изучения синаптической передачи. В личиночной NMJ, в том числе внутриклеточный записи синаптических потенциалов, записи синаптических токов с двумя электродами напряжение зажим33,34и фокуса macropatch …
The authors have nothing to disclose.
Поддержке гранта NIH R01 MH 099557
Sutter P-97 | Sutter instrument | P-97 | Microelectrode puller |
Narishige MF-830 | Narishige | MF-830 | Microforge |
WPI MF200 | WPI | MF200 | Microforge |
Glass capilaries | WPI | B150-86-10 | Glass capilaries |
Microtorch 1WG61 | Grainer | 1WG61 | Microtorch |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD 184 | Silicone for dissection plates preparation |
Dissection pins | Amazon | B00J5PMPJA | Pins for larvae positioning |
Tweezers | WPIINC | 500342 | Tweezers for placing pins, removing the guts and tracheas. |
Scissors | WPIINC | 501778 | Scissors for cutting the cuticula of the larvae and nerves. |
Olympus BX61WI | Olympus | BX61WI | Upright microscope |
Olympus Lumplan FL N 60x | Olympus | UPLFLN 60X | Microscope objective 60X |
Olympus UPlan FL N 10x | Olympus | Uplanfl N 10X | Microscope objective 10X |
Narishige Micromanipulator | Narishige | MHW-3 | Three-axis Water Hydraulic Micromanipulator |
npi Electronic GmbH ELC-03XS | npi Electronic GmbH | ELC-03XS | Electrophysiological amplifier |
A.M.P.I Master 8 | A.M.P.I. | Master 8 | Electrical stimulator |
A.M.P.I Iso-Flex | A.M.P.I. | Iso-Flex | Stimulus isolator |
TMC antivibration table | TMC | 63-9090 | Antivibration table |
TMC Faraday cage | TMC | 81-333-90 | Faraday cage |
Digidata 1322A | Axon Instruments | Digidata 1322A | Digidata |
Computer | Dell | Dell Dimension 5150 | Computer with Win XP OS |
Electrode holder | WPI | MEH3SW | Electrode holder |
Optical filter | Omega optical | XF 115-2 | Filter cube for Green Fluorescent Protein (GFP) detection |
pCLAMP 8 | Axon Instruments | 8.0.0.81 | Software for signal recording |
Quantan | In-house software | – | Software for signal processing |
Canton-S (Wildtype) | Bloomington Stock Center | 64349 | Control fly line |
cpx SH1 | Generous Gift of J.T. Littleton | – | Complexin knock-out fly line with increased spontaneous exocytosis |
CD8-GFP | Bloomington Stock Center | 5137 | Fly line with neuronal fluorescent (GFP) Tag |