在果蝇第三龄幼虫神经肌肉交界处, 可从可视化突触 boutons 局部记录突触电流。这种技术可以监测单个突触溥的活动。
果蝇神经肌肉结 (NMJ) 是研究谷氨酸突触传递的一个很好的模型系统。我们描述了从可视化 boutons 在果蝇幼虫 NMJ 的突触电流的焦 macropatch 记录技术。这项技术需要定制制作记录 micropipettes, 以及一个复合显微镜, 配备了高倍率, 长距离水浸泡物镜, 差分干扰对比 (DIC) 光学, 和荧光附件.记录电极定位在选定的突触溥的顶部, 与 DIC 光学, epi 荧光, 或两者。这种技术的优点是它允许监测有限数量的释放点的突触活动。该记录电极的直径为几微米, 而位于电极外缘外的释放位置不会对记录的电流产生显著影响。记录的突触电流具有快速的动力学, 可以很容易地解决。这些优势是特别重要的研究突变飞线与增强自发或异步突触活动。
果蝇是研究控制突触传递的分子机制的一个很好的模型系统。在果蝇的神经肌肉系统是谷氨酸, 因此,果蝇神经肌肉结 (NMJ) 可以用来研究谷氨酸释放的保守特征。自1月和1月的研究1, 第三龄幼虫已广泛用于研究诱发和自发突触传播通过监测兴奋性结电位 (EJPs) 或电流 (EJCs)。EJPs 通常记录细胞与一个尖锐的玻璃微电极, 它们反映了整个 NMJ 的活动, 包括所有的 boutons 在给定的肌肉纤维的突触。
相比之下, 通过在神经元终端或突触静脉曲张附近定位一个微尖端, 可以记录局部的少量释放点的活动。这项技术最初受聘于 Katz 和 Miledi2, 并成功地使用了一些 NMJ 准备, 包括青蛙3,4,5, 鼠标6,7,8, 甲壳动物9,10,11,12,13,14,15,16, 和果蝇17,18,19,20,21,22,23。这一方法进一步开发了 Dudel, 谁优化 macropatch 重新编码电极24,25。在 Dudel 的实现中, 此技术与松散膜片钳方法26紧密匹配。
果蝇幼虫 NMJ 已明确定义突触 boutons, 和基因编码的神经荧光标记的转基因品系 (见材料表) 是现成的。这些优势使我们能够记录 EJCs 和 mEJCs 从一个选定的突触溥20,21,22。在这里, 我们详细描述这一技术。
果蝇代表了研究突触传递的一个有利的模型有机体。在幼体 NMJ 使用了几种记录配置, 包括突触电位的胞内记录、两个电极电压钳33、34和焦点 macropatch 的突触电流记录。在这里描述的突触电流的录音。后一种技术允许精确定量的突触传输在可视化的 boutons。
所描述的协议的成功与否, 关键取决于是否有能力清楚地直观地显示感…
The authors have nothing to disclose.
由 NIH 资助 R01 MH 099557
Sutter P-97 | Sutter instrument | P-97 | Microelectrode puller |
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WPI MF200 | WPI | MF200 | Microforge |
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Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD 184 | Silicone for dissection plates preparation |
Dissection pins | Amazon | B00J5PMPJA | Pins for larvae positioning |
Tweezers | WPIINC | 500342 | Tweezers for placing pins, removing the guts and tracheas. |
Scissors | WPIINC | 501778 | Scissors for cutting the cuticula of the larvae and nerves. |
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Narishige Micromanipulator | Narishige | MHW-3 | Three-axis Water Hydraulic Micromanipulator |
npi Electronic GmbH ELC-03XS | npi Electronic GmbH | ELC-03XS | Electrophysiological amplifier |
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