Synaptic stromingen kunnen focally worden opgenomen van de gevisualiseerde synaptic los op de Drosophila derde instar larven motorische eindplaat. Deze techniek maakt het mogelijk de activiteiten van een enkele synaptic bouton worden gecontroleerd.
Drosophila motorische eindplaat (NMJ) is een uitstekend modelsysteem te bestuderen van glutamaterge synaptische transmissie. We beschrijven de techniek van focal macropatch opnames van synaptic stromingen van de gevisualiseerde los op de Drosophila larvale NMJ. Deze techniek vereist aangepaste fabricage van opname micropipetten, evenals een samengestelde microscoop uitgerust met een hoge vergroting, interlokale water onderdompeling doelstelling, differentiële interferentie contrast (DIC) optica en een TL bijlage. De opname-elektrode is geplaatst op de top van een geselecteerde synaptic bouton gevisualiseerd met DIC optica, epi-fluorescentie, of beide. Het voordeel van deze techniek is dat het zorgt voor de opvolging van de synaptische activiteit van een beperkt aantal sites van release. De opname-elektrode heeft een diameter van enkele microns en de release-sites geplaatst buiten de elektrode velg niet noemenswaardig verstoord de opgenomen stromingen. De opgenomen synaptic stromingen hebben snel kinetiek en kunnen gemakkelijk worden opgelost. Deze voordelen zijn vooral belangrijk voor de studies van mutant vliegen lijnen met versterkte spontane of asynchrone synaptic activiteit.
Drosophila is een uitstekend modelsysteem te bestuderen van de moleculaire mechanismen beheersen van synaptische transmissie. Het neuromusculaire systeem in Drosophila is glutamaterge, en daarom de Drosophila motorische eindplaat (NMJ) kan worden gebruikt voor het bestuderen van de geconserveerde eigenschappen van glutamaterge versie. Sinds Jan en Jan zijn studie1, de derde instar-larven in het algemeen gebruikt om te bestuderen evoked en spontane synaptische transmissie door het toezicht op de excitatory kruising potentieel (EJPs) of stromen (EJCs). EJPs vaak opgenomen intracellulair met een scherpe glas micro-elektrode en worden ze weerspiegelen de activiteit van de gehele NMJ, met inbegrip van alle de los maken van synapsen in de gegeven spiervezel.
Daarentegen kan de activiteit van een beperkt aantal van de sites van release focally worden opgenomen door het plaatsen van een tip van de micropipet in de buurt van neuronale terminals of synaptische varicosities. Deze techniek werd oorspronkelijk gebruikt door Katz en Miledi2, en focale extracellulaire opnames hebben gewerkt op verschillende NMJ preparaten, met inbegrip van kikker3,4,5, muis6 , 7 , 8, schaaldieren9,10,11,12,13,14,15,16, en Drosophila17,18,19,20,21,22,23. Deze aanpak werd verder ontwikkeld door Dudel, die geoptimaliseerd macropatch elektroden24,25te hercoderen. In Dudel van de uitvoering, en deze techniek toelichtingen de los-patch-clamp methode26.
De Drosophila larvale NMJ heeft duidelijk omschreven synaptic los en transgene lijnen met genetisch gecodeerde neuronale fluorescerende labels (Zie Tabel van materialen) beschikbaar zijn. Deze voordelen ons in staat gesteld om EJCs en mEJCs van een geselecteerde synaptic bouton20,21,22te registreren. Hier beschrijven we deze techniek in detail.
Drosophila vertegenwoordigt een voordelige model-organisme te bestuderen van synaptische transmissie. Verschillende configuraties van de opname zijn gebruikt bij de larvale NMJ, met inbegrip van intracellulaire opnames van synaptic potentiëlen, opnames van synaptic stromingen met twee elektrode spanning klem33,34, en focale macropatch opnames van synaptic stromingen die hier worden beschreven. De laatste techniek staat de precieze kwantificering van syn…
The authors have nothing to disclose.
Ondersteund door de NIH-subsidie R01 MH 099557
Sutter P-97 | Sutter instrument | P-97 | Microelectrode puller |
Narishige MF-830 | Narishige | MF-830 | Microforge |
WPI MF200 | WPI | MF200 | Microforge |
Glass capilaries | WPI | B150-86-10 | Glass capilaries |
Microtorch 1WG61 | Grainer | 1WG61 | Microtorch |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD 184 | Silicone for dissection plates preparation |
Dissection pins | Amazon | B00J5PMPJA | Pins for larvae positioning |
Tweezers | WPIINC | 500342 | Tweezers for placing pins, removing the guts and tracheas. |
Scissors | WPIINC | 501778 | Scissors for cutting the cuticula of the larvae and nerves. |
Olympus BX61WI | Olympus | BX61WI | Upright microscope |
Olympus Lumplan FL N 60x | Olympus | UPLFLN 60X | Microscope objective 60X |
Olympus UPlan FL N 10x | Olympus | Uplanfl N 10X | Microscope objective 10X |
Narishige Micromanipulator | Narishige | MHW-3 | Three-axis Water Hydraulic Micromanipulator |
npi Electronic GmbH ELC-03XS | npi Electronic GmbH | ELC-03XS | Electrophysiological amplifier |
A.M.P.I Master 8 | A.M.P.I. | Master 8 | Electrical stimulator |
A.M.P.I Iso-Flex | A.M.P.I. | Iso-Flex | Stimulus isolator |
TMC antivibration table | TMC | 63-9090 | Antivibration table |
TMC Faraday cage | TMC | 81-333-90 | Faraday cage |
Digidata 1322A | Axon Instruments | Digidata 1322A | Digidata |
Computer | Dell | Dell Dimension 5150 | Computer with Win XP OS |
Electrode holder | WPI | MEH3SW | Electrode holder |
Optical filter | Omega optical | XF 115-2 | Filter cube for Green Fluorescent Protein (GFP) detection |
pCLAMP 8 | Axon Instruments | 8.0.0.81 | Software for signal recording |
Quantan | In-house software | – | Software for signal processing |
Canton-S (Wildtype) | Bloomington Stock Center | 64349 | Control fly line |
cpx SH1 | Generous Gift of J.T. Littleton | – | Complexin knock-out fly line with increased spontaneous exocytosis |
CD8-GFP | Bloomington Stock Center | 5137 | Fly line with neuronal fluorescent (GFP) Tag |