ניתן להקליט זרמים סינפטית focally מ עם העיתון ons סינפטית מטמיעים בצומת דרוזופילה השלישי לחלל הזחלים עצב-שריר. טכניקה זו מאפשרת פיקוח על הפעילות של בוטון סינפטית יחיד.
צומת עצב-שריר דרוזופילה (NMJ) היא מערכת מודל מצויין ללמוד הסינאפסית glutamatergic. אנו מתארים את הטכניקה של מוקד macropatch הקלטות של זרמי סינפטית מ עם העיתון ons מטמיעים ב- NMJ זחל דרוזופילה . טכניקה זו דורשת מותאם אישית פבריקציה נוספת של הקלטה micropipettes, כמו גם מיקרוסקופ המתחם מצויד בהגדלה גדולה, המטרה טבילה במים למרחקים ארוכים, אופטיקה חדות (DIC) התערבות דיפרנציאלית של פלורסנט קובץ מצורף. האלקטרודה הקלטה ממוקם בחלק העליון בוטון סינפטית שנבחר דמיינו אופטיקה DIC, epi-זריחה, או שניהם. היתרון של שיטה זו הוא שהיא מאפשרת ניטור פעילות סינפטית של מספר מצומצם של אתרים של שחרור. האלקטרודה ההקלטה יש קוטר של מספר מיקרונים, האתרים שחרור ממוקם מחוץ לקצה אלקטרודה אינם משפיעים באופן משמעותי את הזרמים המוקלט. הזרמים סינפטית מוקלטות יש קינטיקה מהיר, ניתן לפתור בקלות. יתרונות אלה חשובים במיוחד עבור הלימודים של קווי לעוף מוטנטים עם פעילות סינפטית משופרת ספונטני או אסינכרוני.
דרוזופילה הוא מערכת מודל מצוין לחקור את המנגנונים המולקולריים שליטה הסינאפסית. מערכת neuromuscular דרוזופילה הוא glutamatergic, ולכן צומת עצב-שריר דרוזופילה (NMJ) יכול לשמש כדי לחקור את התכונות ההכפלה של שחרור glutamatergic. מאז של יאן וג’ן מחקר1, הזחלים לחלל השלישי שימש בהרחבה ללמוד עורר וספונטני הסינאפסית על-ידי ניטור צומת סינאפסות פוטנציאל (EJPs) או זרמי (שלטון). EJPs בדרך כלל נרשמים intracellularly עם מיקרו-אלקטרודת זכוכית חדים, הם משקפים את הפעילות של NMJ כולו, כולל כל עם העיתון ons עושה הסינפסות סיבי השריר נתון.
לעומת זאת, הפעילות של מספר מוגבל של האתרים של שחרור ניתן להקליט focally על-ידי הצבת טיפ micropipette ליד מסופי עצביים או varicosities סינפטית. טכניקה זו במקור מועסק על ידי כץ ו Miledi2, הקלטות חוץ-תאית מוקד יש כבר מועסקים בהצלחה ב מספר הכנות NMJ, כולל צפרדע3,4,5, העכבר6 , 7 , 8, סרטנאים9,10,11,12,13,14,15,16, ו- דרוזופילה17,18,19,20,21,22,23. גישה זו פותחה עוד יותר על ידי Dudel, אשר מותאם במיוחד macropatch recoding אלקטרודות24,25. בהטמעה של Dudel, טכניקה זו התאימה היטב רופף-תיקון-קלאמפ שיטת26.
NMJ זחל דרוזופילה הגדירה בבירור עם העיתון ons סינפטית, קווים הטרנסגניים בתגים מקודדים גנטית פלורסנט עצביים (ראה טבלה של חומרים) זמינים. יתרונות אלה אפשרו לנו להקליט שלטון ו mEJCs מ21,20,22שנבחר בוטון סינפטית. כאן, אנו מתארים את טכניקה זו בפירוט.
דרוזופילה מייצג אורגניזם מודל יתרון ללמוד הסינאפסית. מספר תצורות הקלטה השתמשו ב- NMJ זחל, כולל הקלטות תאיים של סינאפטיים, הקלטות של זרמי סינפטית עם שתי האלקטרודות מתח קלאמפ33,34, מיקוד macropatch הקלטות של זרמי סינפטית המתוארים כאן. הטכניקה השנייה מאפשרת כימות …
The authors have nothing to disclose.
נתמך על ידי המענק-NIH R01 MH 099557
Sutter P-97 | Sutter instrument | P-97 | Microelectrode puller |
Narishige MF-830 | Narishige | MF-830 | Microforge |
WPI MF200 | WPI | MF200 | Microforge |
Glass capilaries | WPI | B150-86-10 | Glass capilaries |
Microtorch 1WG61 | Grainer | 1WG61 | Microtorch |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD 184 | Silicone for dissection plates preparation |
Dissection pins | Amazon | B00J5PMPJA | Pins for larvae positioning |
Tweezers | WPIINC | 500342 | Tweezers for placing pins, removing the guts and tracheas. |
Scissors | WPIINC | 501778 | Scissors for cutting the cuticula of the larvae and nerves. |
Olympus BX61WI | Olympus | BX61WI | Upright microscope |
Olympus Lumplan FL N 60x | Olympus | UPLFLN 60X | Microscope objective 60X |
Olympus UPlan FL N 10x | Olympus | Uplanfl N 10X | Microscope objective 10X |
Narishige Micromanipulator | Narishige | MHW-3 | Three-axis Water Hydraulic Micromanipulator |
npi Electronic GmbH ELC-03XS | npi Electronic GmbH | ELC-03XS | Electrophysiological amplifier |
A.M.P.I Master 8 | A.M.P.I. | Master 8 | Electrical stimulator |
A.M.P.I Iso-Flex | A.M.P.I. | Iso-Flex | Stimulus isolator |
TMC antivibration table | TMC | 63-9090 | Antivibration table |
TMC Faraday cage | TMC | 81-333-90 | Faraday cage |
Digidata 1322A | Axon Instruments | Digidata 1322A | Digidata |
Computer | Dell | Dell Dimension 5150 | Computer with Win XP OS |
Electrode holder | WPI | MEH3SW | Electrode holder |
Optical filter | Omega optical | XF 115-2 | Filter cube for Green Fluorescent Protein (GFP) detection |
pCLAMP 8 | Axon Instruments | 8.0.0.81 | Software for signal recording |
Quantan | In-house software | – | Software for signal processing |
Canton-S (Wildtype) | Bloomington Stock Center | 64349 | Control fly line |
cpx SH1 | Generous Gift of J.T. Littleton | – | Complexin knock-out fly line with increased spontaneous exocytosis |
CD8-GFP | Bloomington Stock Center | 5137 | Fly line with neuronal fluorescent (GFP) Tag |