Imágenes en vivo de la migración de células epiteliales de mama después del agotamiento transitorio de TIP60
Summary
Aquí, presentamos el seguimiento en tiempo real de la migración de la célula en un ensayo de cicatrización utilizando células epiteliales de mama MCF10A TIP60-agotado. La aplicación de técnicas de imagen de células vivas en nuestro protocolo nos permite analizar y visualizar sola célula movimiento en tiempo real y a través del tiempo.
Abstract
La cicatrización es eficiente y una de las maneras más económicas para el estudio de la migración celular in vitro. Convencionalmente, se toman imágenes al principio y al final de un experimento usando un microscopio de contraste de fase, y se evalúan las capacidades de migración de las células por el cierre de heridas. Sin embargo, movimiento celular es un fenómeno dinámico, y un método convencional no permite rastrear movimiento unicelular. Para mejorar el actuales análisis de cicatrización, utilizamos técnicas de imágenes de células vivas para controlar la migración de la célula en tiempo real. Este método permite determinar la tasa de migración de la célula basada en una sistema de seguimiento de la célula y proporciona una distinción más clara entre la migración celular y proliferación celular. Aquí, se demuestra el uso de imágenes de células vivas en la cicatrización de ensayos para el estudio de las capacidades diferentes de la migración de células epiteliales de mama por la presencia de TIP60. Como la motilidad celular es altamente dinámica, nuestro método ofrece más ideas en los procesos de cicatrización que una instantánea del encierro de la herida con las tradicionales técnicas de imagen utilizadas para los ensayos de la cicatrización.
Introduction
Proteína VIH Tat interactivo 60 kDa (TIP60) es una lisina acetiltransferasa que puede acetylate histonas y proteínas no histonas1,2. Sus funciones se encuentran que tienen implicaciones en múltiples vías de señalización, incluyendo transcripción, reparación del daño de la DNA y apoptosis1,3,4,5,6, 7 , 8. Además, TIP60 es a menudo o en casos de cáncer y su regulación a la baja se correlaciona con la metástasis de cáncer y supervivencia pobre precios9,10,11,12, 13,14. Metástasis tumoral es la principal causa de muerte relacionada con cáncer. Es un proceso multi-step, y el paso inicial de la metástasis implica la migración y la invasión de células tumorales en los tejidos adyacentes15,16. Para ello, las células del tumor primero deben separar de la masa del tumor primario, ya sea en la forma de una hoja de células colectivamente invasores o como independiente de las células17. Durante este proceso, las células del tumor a menudo se someten a epitelial de transición mesenquimal (EMT), resultando en cambios en la morfología y la célula adherencia capacidad17,18.
Se han desarrollado algunas técnicas para estudiar la migración y capacidad de invasión del tumor de las células en vitro. Entre ellos, la cicatrización es más eficiente y económico19. En primer lugar, este método implica la creación de un espacio artificial en una monocapa confluente de células, lo que permite a las células migrar y cerrar la brecha. En segundo lugar, se pueden capturar imágenes de los espacios al principio y al final del experimento. Por último, una comparación de cierre de brecha se utiliza para determinar la tasa de migración de la célula. Un microscopio de contraste de fase se utiliza generalmente para capturar imágenes para los ensayos convencionales de cicatrización. Otra de las ventajas del ensayo de cicatrización es que en parte se asemeja en vivo la migración celular tumoral. Del mismo modo a metástasis de tumor en vivo , migración celular en la cicatrización de los ensayos muestra la migración colectiva de hojas epiteliales y la migración de las células individuales separadas.
Sin embargo, la migración celular es conocida por ser dinámico y es necesario documentar el movimiento de las células en tiempo real. Por ejemplo, un ensayo de cicatrización convencional no permite un investigador analizar sola célula movimiento. Por otro lado, las células cultivadas para los ensayos de cicatrización suelen ser sediento de suero para inhibir la proliferación celular. Esto se hace para descartar la posibilidad de cierre de la brecha debido a la proliferación celular. Sin embargo, todavía habrá algunos proliferación y muerte celular e imágenes de contraste de fase tomadas antes y después del experimento son incapaces de distinguir entre ellos.
La técnica de imágenes de células vivas dirige a esta limitación de ensayos convencionales de cicatrización. Utilizando un microscopio de proyección de imagen en vivo combinado con un incubador de CO2 y control de la temperatura adecuada, los investigadores pueden medir el tamaño de la brecha y su velocidad de cierre en el tiempo mientras que rastrear el movimiento de migración activa de células ubicadas en las puntas de los frente invasivo. Por lo tanto, la aplicación de células vivas para controlar la migración de células de la proyección de imagen no sólo proporcionará el mejor visualización de la migración de la célula, pero también permite la posibilidad de diferenciar entre la migración celular y proliferación celular, proporcionando así más Análisis fiable de la migración de la célula.
En este estudio, las células epiteliales de la mama MCF10A fueron utilizadas para demostrar la combinación de la cicatrización análisis y proyección de imagen para estudiar el papel de TIP60 en migración celular con células vivas. El agotamiento de los TIP60 resultados en habilidades de aumento de la migración de células MCF10A.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se sabe que en el proceso de migración de la célula, las células pueden cualquiera movimiento en forma de fichas de adherentes; racimos flojos; o células individuales, aisladas. El modo y la dinámica de invasión celular pueden variar de un estado a otro, y el fenotipo puede cambiar dentro de las horas. El ensayo de cicatrización tradicional se basa en fotografías instantáneas de un microscopio con un intervalo de tiempo, tales como de 12 o 24 horas. Esto hace difícil de capturar la dinámica de cierre de la her…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los miembros del laboratorio Jai por su útil discusión y comentarios. S.J. fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de investigación de Singapur y el Ministerio de Educación de Singapur en sus centros de investigación de la iniciativa de excelencia al cáncer la ciencia Instituto de Singapur (R-713-006-014-271), los médicos nacionales Consejo de investigación (CBRG-NIG; BNIG11nov001 y CS-IRG; R-713-000-162-511), el fondo de investigación del Ministerio de Educación (MOE AcRF nivel 1 T1-2012 Oct -04). Y.Z. G.S.C. y C.Y.T. fueron apoyados por una beca de postgrado otorgada por el Instituto de ciencia cáncer de Singapur, Universidad Nacional de Singapur.
Materials
| MCF10A cell | ATCC | CRL-10317TM | Breast epithelial cell |
| DMEM/F12 media (1:1) | Gibco | 11330-032 | MCF10A culture media |
| Epithelial growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Supplements for MCF10A culture media |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C-8052 | Supplements for MCF10A culture media |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-0888 | Supplements for MCF10A culture media |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-1882 | Supplements for MCF10A culture media |
| House serum | Gibco | 16050-122 | Supplements for MCF10A culture media |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | For MCF10A detach from plate |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | For counting cell |
| Opti-MEM reduced serum media | Gibco | 31985-070 | For siRNA mixture |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen/Life Technologies | 56532 | Transfect reagent |
| Trizol reagent | Invitrogen/Life Technologies | 15596-026 | For mRNA extraction |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8891 | For cDNA generation |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5125 | For real time qPCR |
| 7500 Fast Real Time PCR system | Biosystems | Real time qPCR mechine | |
| 10-cm dish | Greiner bio-one | 664160 | For Knockdown experiment |
| 24-well plate | Cellstar | 662160 | For wound healing assay |
| siControl siRNA | Self designed | Self designed | CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT |
| siTIP60 siRNA | Self designed | Self designed | UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT |
| Live cell observer | Zeiss | Zeiss inverted Cell Observer for live cell experiments |
References
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