يعيش-تصوير الثدي الخلايا الظهارية الهجرة بعد استنفاد عابر TIP60
Summary
نقدم هنا، رصد في الوقت الحقيقي للهجرة الخلية في مقايسة التئام الجروح استخدام TIP60 المنضب MCF10A الثدي الخلايا الظهارية. تنفيذ تقنيات التصوير خلية يعيش في أن البروتوكول يسمح لنا بتحليل ووضع تصور لحركة خلية واحدة في الوقت الحقيقي وعبر الوقت.
Abstract
والرزن التئام الجروح بكفاءة، وواحدة من الطرق الأكثر اقتصادا لدراسة الهجرة الخلايا في المختبر. تقليديا، يتم أخذ صور في بداية ونهاية لتجربة استخدام مجهر تباين مرحلة، ويتم تقييم قدرات الهجرة من الخلايا بواسطة إغلاق الجروح. بيد أن حركة الخلية ظاهرة ديناميكية ولا تسمح طريقة تقليدية لتتبع حركة خلية واحدة. تحسين فحوصات التئام الحالية، نحن نستخدم تقنيات التصوير خلية يعيش لمراقبة الهجرة الخلية في الوقت الحقيقي. هذا الأسلوب يسمح لنا بتحديد معدل الهجرة الخلية استناداً إلى خلية تتبع النظام ويوفر تمييز أوضح بين الهجرة الخلية وتكاثر الخلايا. هنا، نحن توضح استخدام التصوير خلية يعيش في التئام فحوصات لدراسة قدرات الهجرة مختلفة من الخلايا الظهارية في الثدي تتأثر بوجود TIP60. كما خلية حركية ديناميكية للغاية، لدينا أسلوب يوفر المزيد من الأفكار في العمليات للشفاء من لقطة لإغلاق الجرح المتخذة مع تقنيات التصوير التقليدية المستخدمة لفحوصات التئام الجرح.
Introduction
فيروس نقص المناعة البشرية-تأت-التفاعلية البروتين 60 كاتشين (TIP60) هو أسيتيلترانسفيراسي يسين التي يمكن acetylate هيستون والبروتينات غير هيستون1،2. تم العثور على وظائفها أن تترتب عليه آثار في مسارات إشارات متعددة، بما في ذلك النسخ وإصلاح أضرار الحمض النووي، والمبرمج1،،من34،،من56، 7 , 8-وعلاوة على ذلك، TIP60 في كثير من الأحيان دوونريجولاتيد في أمراض السرطان، ويرتبط به دوونريجوليشن بسرطان خبيث ومعدلات البقاء على قيد الحياة الفقيرة9،10،،من1112، 13،14. ورم خبيث هو السبب الرئيسي للوفاة المتعلقة بالسرطان. أنها عملية متعددة الخطوات، وأن الخطوة الأولى لورم خبيث ينطوي على الهجرة وغزو الخلايا السرطانية في الأنسجة المجاورة15،16. أولاً الخلايا السرطانية يجب فصلها من كتلة الورم الرئيسي، أما في شكل ورقة الخلية الغازية جماعياً من أجل القيام بذلك، أو كفصل الخلايا المفردة17. أثناء هذه العملية، كثيرا ما الخضوع ورم الخلايا الظهارية للمرحلة الانتقالية الوسيطة (EMT)، أسفر عن تغييرات في خلية ومورفولوجيا التصاق قدرة17،18.
وقد وضعت بعض التقنيات لدراسة الهجرة والقدرة على غزو من ورم الخلايا في المختبر. فيما بينها، هو مقايسة التئام الأكثر كفاءة واقتصادا19. أولاً، يتضمن هذا الأسلوب إنشاء فجوة مصطنعة على أحادي الطبقة المتلاقية للخلايا، مما يسمح للخلايا ترحيل وسد الفجوة. ثانيا، يمكن التقاط الصور للثغرات الموجودة في بداية ونهاية التجربة. وأخيراً، يستخدم مقارنة لإغلاق الفجوة لتحديد معدل الهجرة الخلية. مجهر تباين مرحلة يستخدم عادة لالتقاط الصور لفحوصات التئام التقليدية. ميزة أخرى للمقايسة التئام الجروح أنه يشبه جزئيا في فيفو ورم الخلايا الهجرة. وبالمثل في فيفو ورم خبيث، الهجرة الخلية في فحوصات التئام يبين الهجرة الجماعية من أوراق الظهارية وهجرة الخلايا المفردة المنفصلة.
بيد أن الهجرة الخلية من المعروف أن دينامية، وهناك حاجة توثيق حركة الخلايا في الوقت الحقيقي. على سبيل المثال، لا يسمح مقايسة التئام تقليدية باحث لتحليل حركة خلية واحدة. من ناحية أخرى، والخلايا المزروعة لفحوصات التئام غالباً المتعطشة لمصل تمنع انتشار الخلايا. ويتم ذلك لاستبعاد إمكانية إغلاق الفجوة بسبب انتشار الخلايا. ومع ذلك، ستكون هناك بعض الانتشار وموت الخلايا، ومرحلة التباين الصور التي التقطت قبل وبعد التجربة غير قادرين على التفريق بينهما.
تقنية التصوير خلية يعيش يعالج هذا التقييد لفحوصات التئام التقليدية. استخدام مجهر تصوير العيش جنبا إلى جنب مع CO2 حاضنة والتحكم في درجة الحرارة المناسبة، الباحثين ويمكن قياس حجم الفجوة ومعدل الإغلاق مع مرور الوقت في حين تتبع حركة الهجرة بنشاط الخلايا الموجودة على النصائح من الجبهة الغازية. ومن ثم، لن يوفر فقط تصور أفضل للهجرة الخلية تنفيذ خلية يعيش التصوير لمراقبة الهجرة الخلية، ولكن سيسمح أيضا بإمكانية التفريق بين الهجرة الخلية وتكاثر الخلايا، وبالتالي توفير المزيد تحليل موثوق للهجرة الخلية.
في هذه الدراسة، استخدمت MCF10A الثدي الخلايا الظهارية لإثبات الجمع بين التحليل وخلية يعيش التصوير لدراسة دور TIP60 في الهجرة الخلية التئام الجروح. نتائج استنزاف TIP60 في الهجرة زيادة القدرات في الخلايا MCF10A.
Protocol
Representative Results
Discussion
ومن المعروف أن الخلايا يمكن أن عملية الهجرة الخلية، أما التحرك في شكل أوراق ملتصقة؛ مجموعات فضفاضة؛ أو خلايا وحيدة ومعزولة. الوضع ودينامية لغزو الخلية يمكن أن تختلف من شرط واحد إلى آخر، ويمكنك تغيير النمط الظاهري في غضون ساعة. ويستند المقايسة التئام التقليدية صور لقطة مأخوذة من مجهر مع فت…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر أعضاء المختبر جها لمناقشة مفيدة وتعليقات. وأيده عدد المنح المقدمة من سنغافورة “المؤسسة الوطنية للبحوث” ووزارة التعليم سنغافورة تحت مراكزها البحثية لمبادرة التميز “السرطان العلوم معهد سنغافورة” (R-713-006-014-271)، الطبية الوطنية مجلس البحوث (كبرج-NIG؛ BNIG11nov001 وخدمات العملاء-أسندت؛ R-713-000-162-511)، صندوق البحث الأكاديمي في وزارة التربية والتعليم (وزارة التربية والتعليم أكرف الطبقة الأولى T1-2012 أكتوبر-04). وأيد زمالة الدراسات العليا تمنحها “السرطان العلوم معهد سنغافورة”، جامعة سنغافورة الوطنية، Y.Z.، G.S.C.، و C.Y.T..
Materials
| MCF10A cell | ATCC | CRL-10317TM | Breast epithelial cell |
| DMEM/F12 media (1:1) | Gibco | 11330-032 | MCF10A culture media |
| Epithelial growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Supplements for MCF10A culture media |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C-8052 | Supplements for MCF10A culture media |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-0888 | Supplements for MCF10A culture media |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-1882 | Supplements for MCF10A culture media |
| House serum | Gibco | 16050-122 | Supplements for MCF10A culture media |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | For MCF10A detach from plate |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | For counting cell |
| Opti-MEM reduced serum media | Gibco | 31985-070 | For siRNA mixture |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen/Life Technologies | 56532 | Transfect reagent |
| Trizol reagent | Invitrogen/Life Technologies | 15596-026 | For mRNA extraction |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8891 | For cDNA generation |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5125 | For real time qPCR |
| 7500 Fast Real Time PCR system | Biosystems | Real time qPCR mechine | |
| 10-cm dish | Greiner bio-one | 664160 | For Knockdown experiment |
| 24-well plate | Cellstar | 662160 | For wound healing assay |
| siControl siRNA | Self designed | Self designed | CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT |
| siTIP60 siRNA | Self designed | Self designed | UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT |
| Live cell observer | Zeiss | Zeiss inverted Cell Observer for live cell experiments |
References
- Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Fernandes, N., Price, B. D. A role for the Tip60 histone acetyltransferase in the acetylation and activation of ATM. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13182-13187 (2005).
- Sykes, S. M., Stanek, T. J., Frank, A., Murphy, M. E., McMahon, S. B. Acetylation of the DNA binding domain regulates transcription-independent apoptosis by p53. J Biol Chem. 284 (30), 20197-20205 (2009).
- Jha, S., Shibata, E., Dutta, A. Human Rvb1/Tip49 is required for the histone acetyltransferase activity of Tip60/NuA4 and for the downregulation of phosphorylation on H2AX after DNA damage. Mol Cell Biol. 28 (8), 2690-2700 (2008).
- Sapountzi, V., Logan, I. R., Robson, C. N. Cellular functions of TIP60. Int J Biochem Cell Biol. 38 (9), 1496-1509 (2006).
- Squatrito, M., Gorrini, C., Amati, B. Tip60 in DNA damage response and growth control: many tricks in one HAT. Trends Cell Biol. 16 (9), 433-442 (2006).
- Sun, Y., Xu, Y., Roy, K., Price, B. D. DNA damage-induced acetylation of lysine 3016 of ATM activates ATM kinase activity. Mol Cell Biol. 27 (24), 8502-8509 (2007).
- Sykes, S. M., et al. Acetylation of the p53 DNA-binding domain regulates apoptosis induction. Mol Cell. 24 (6), 841-851 (2006).
- Tang, Y., Luo, J., Zhang, W., Gu, W. Tip60-dependent acetylation of p53 modulates the decision between cell-cycle arrest and apoptosis. Mol Cell. 24 (6), 827-839 (2006).
- Chen, G., Cheng, Y., Tang, Y., Martinka, M., Li, G. Role of Tip60 in human melanoma cell migration, metastasis, and patient survival. J Invest Dermatol. 132 (11), 2632-2641 (2012).
- Gorrini, C., et al. Tip60 is a haplo-insufficient tumour suppressor required for an oncogene-induced DNA damage response. Nature. 448 (7157), 1063-1067 (2007).
- Jha, S., et al. Destabilization of TIP60 by human papillomavirus E6 results in attenuation of TIP60-dependent transcriptional regulation and apoptotic pathway. Mol Cell. 38 (5), 700-711 (2010).
- Kim, J. H., et al. Transcriptional regulation of a metastasis suppressor gene by Tip60 and beta-catenin complexes. Nature. 434 (7035), 921-926 (2005).
- Sakuraba, K., et al. Down-regulation of Tip60 gene as a potential marker for the malignancy of colorectal cancer. Anticancer Res. 29 (10), 3953-3955 (2009).
- Subbaiah, V. K., et al. E3 ligase EDD1/UBR5 is utilized by the HPV E6 oncogene to destabilize tumor suppressor TIP60. Oncogene. , (2015).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Zijl, F., Krupitza, G., Mikulits, W. Initial steps of metastasis: cell invasion and endothelial transmigration. Mutat Res. 728 (1-2), 23-34 (2011).
- Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 178-196 (2014).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
- Zhang, Y., et al. TIP60 inhibits metastasis by ablating DNMT1-SNAIL2-driven epithelial-mesenchymal transition program. J Mol Cell Biol. , (2016).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
- Jonkman, J. E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).
