Жить изображений миграции эпителиальных клеток молочной железы после переходных истощение TIP60
Summary
Здесь мы представляем, мониторинг в реальном времени миграции клеток в assay ранозаживляющее, с использованием обедненного TIP60 MCF10A эпителиальных клеток молочной железы. Осуществление методы визуализации живой клетки в нашем протокол позволяет нам анализировать и визуализировать одной ячейки движения в режиме реального времени и во времени.
Abstract
Ранозаживляющее assay является эффективным и один из самых экономичных способов для изучения миграции клеток в пробирке. Условно изображения взяты в начале и в конце эксперимента с помощью микроскопа фазово контрастной и миграции способности клеток оцениваются путем закрытия раны. Однако движение клеток динамичное явление, и обычный метод не позволяет для отслеживания движения одной ячейки. Для улучшения текущих анализов, ранозаживляющее, мы используем методы визуализации клеток для мониторинга миграции клеток в режиме реального времени. Этот метод позволяет нам определить коэффициент миграции клеток, основанный на ячейке, системы слежения и обеспечивает более четкое различие между клеток миграции и пролиферации клеток. Здесь мы демонстрируем использования изображений живой клетки в ранозаживляющим анализов для изучения миграции различных способностей эпителиальных клеток молочной железы под влиянием присутствия TIP60. Как клетки моторики весьма динамичен, наш метод обеспечивает более понимание процессов заживления чем снимок закрытия РАН с традиционные методы визуализации используется для заживления ран анализов.
Introduction
ВИЧ-ТАТ интерактивная белков 60 кДа (TIP60) является лизин Ацетилтрансфераза, который может acetylate гистона и -гистоны1,2. Его функции находятся будет иметь последствия в нескольких сигнальных путей, включая транскрипции, ремонт повреждения ДНК и апоптоз1,3,4,5,6, 7 , 8. Кроме того, TIP60 часто downregulated в рака и его Даунрегуляция коррелируется с метастазами рака и бедных выживание ставки,9,10,11,12 13,14. Метастазы опухоли является основной причиной смерти, связанных с раком. Это многоэтапный процесс, и первый шаг метастазов включает миграции и вторжение опухолевых клеток в прилегающих тканей15,16. Для того, чтобы сделать это, опухолевые клетки сначала необходимо отсоединить от массы первичной опухоли, либо в форме коллективно вторжение ячейку листа или как отдельный единичных клеток17. В ходе этого процесса опухолевые клетки часто проходят эпителиальных мезенхимальных перехода (EMT), что привело к изменениям в морфологии и ячейки адгезии возможности17,18.
Были разработаны несколько методы для изучения миграции и вторжения способность опухолевых клеток в пробирке. Среди них-заживление assay является наиболее эффективным и экономичным19. Во-первых этот метод предполагает создание искусственного разрыв на вырожденная монослое клеток, таким образом позволяя клетки мигрировать и разрыва. Во-вторых может быть захвачен изображения пробелы в начале и в конце эксперимента. Наконец сравнение разрыва используется для определения скорости миграции клеток. Микроскопом фазово контрастной обычно используется для захвата изображения для обычных анализов, ранозаживляющим. Еще одно преимущество-заживление пробирного является, что он частично напоминает в естественных условиях миграции опухолевых клеток. Аналогично в естественных условиях метастазов опухоли клеток миграции в заживление анализы показывает коллективного миграцию эпителия листов и миграции отдельностоящий одиночных клеток.
Однако миграции клеток, как известно, быть динамичным, и существует необходимость в документе движение клеток в режиме реального времени. Например обычные ранозаживляющим пробирного не позволяют исследователем для анализа движения одной ячейки. С другой стороны клетки культивировали для заживления ран анализов зачастую голодали сыворотки ингибировать пролиферацию клеток. Это делается для исключает возможность разрыва вследствие пролиферации клеток. Тем не менее будет по-прежнему существовать некоторые распространения и гибель клеток и фазово контрастной снимки, сделанные до и после эксперимента не в состоянии провести различие между ними.
Тепловизионная техника клеток устраняет это ограничение обычных анализов, ранозаживляющим. С помощью микроскопа жить изображений в сочетании с CO2 инкубатора и контроля соответствующей температуры, исследователи могут измерять размер интервала и ее показатель закрытия с течением времени, в то время как отслеживание движения активно переход клеток расположен на советы инвазивные фронт. Следовательно осуществление-клеток imaging для мониторинга миграции клеток не только обеспечивают лучшую визуализацию миграции клеток, но будет также предусмотрена возможность различать клеток миграции и пролиферации клеток, обеспечивая тем самым более надежный анализ миграции клеток.
В этом исследовании MCF10A эпителиальных клеток молочной железы были использованы продемонстрировать сочетание ранозаживляющим пробирного и изображений для изучения роли TIP60 в ячейке миграции клеток. Истощение TIP60 приводит к способности рост миграции в MCF10A клетках.
Protocol
Representative Results
Discussion
Известно, что в процессе миграции клеток, клеток можно либо переместить в виде адэрентных листов; свободные кластеры; или один, изолированных клеток. Режим и динамику клеток вторжения может варьироваться от одного состояния к другому, и фенотип можно изменить в пределах часов. Традицио?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим членов Джа лаборатории за их полезные обсуждения и представления замечаний. С.ж. была поддержана субсидии от национального исследовательского фонда Сингапура и Сингапуре Министерство образования под его исследовательскими центрами передового опыта инициативы рака науки Института Сингапура (R-713-006-014-271), национальной медицинской Научно-исследовательский совет (CBRG-Ниг; BNIG11nov001 и CS-IRG; R-713-000-162-511), фонд научных исследований министерство образования (МО AcRF Tier 1 T1-2012 Oct -04). ВМФ, G.S.C. и C.Y.T. были поддержаны аспирантов стипендии наградил Институт рака науки Сингапура, Национальный университет Сингапура.
Materials
| MCF10A cell | ATCC | CRL-10317TM | Breast epithelial cell |
| DMEM/F12 media (1:1) | Gibco | 11330-032 | MCF10A culture media |
| Epithelial growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Supplements for MCF10A culture media |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C-8052 | Supplements for MCF10A culture media |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-0888 | Supplements for MCF10A culture media |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-1882 | Supplements for MCF10A culture media |
| House serum | Gibco | 16050-122 | Supplements for MCF10A culture media |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | For MCF10A detach from plate |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | For counting cell |
| Opti-MEM reduced serum media | Gibco | 31985-070 | For siRNA mixture |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen/Life Technologies | 56532 | Transfect reagent |
| Trizol reagent | Invitrogen/Life Technologies | 15596-026 | For mRNA extraction |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8891 | For cDNA generation |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5125 | For real time qPCR |
| 7500 Fast Real Time PCR system | Biosystems | Real time qPCR mechine | |
| 10-cm dish | Greiner bio-one | 664160 | For Knockdown experiment |
| 24-well plate | Cellstar | 662160 | For wound healing assay |
| siControl siRNA | Self designed | Self designed | CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT |
| siTIP60 siRNA | Self designed | Self designed | UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT |
| Live cell observer | Zeiss | Zeiss inverted Cell Observer for live cell experiments |
References
- Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Fernandes, N., Price, B. D. A role for the Tip60 histone acetyltransferase in the acetylation and activation of ATM. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13182-13187 (2005).
- Sykes, S. M., Stanek, T. J., Frank, A., Murphy, M. E., McMahon, S. B. Acetylation of the DNA binding domain regulates transcription-independent apoptosis by p53. J Biol Chem. 284 (30), 20197-20205 (2009).
- Jha, S., Shibata, E., Dutta, A. Human Rvb1/Tip49 is required for the histone acetyltransferase activity of Tip60/NuA4 and for the downregulation of phosphorylation on H2AX after DNA damage. Mol Cell Biol. 28 (8), 2690-2700 (2008).
- Sapountzi, V., Logan, I. R., Robson, C. N. Cellular functions of TIP60. Int J Biochem Cell Biol. 38 (9), 1496-1509 (2006).
- Squatrito, M., Gorrini, C., Amati, B. Tip60 in DNA damage response and growth control: many tricks in one HAT. Trends Cell Biol. 16 (9), 433-442 (2006).
- Sun, Y., Xu, Y., Roy, K., Price, B. D. DNA damage-induced acetylation of lysine 3016 of ATM activates ATM kinase activity. Mol Cell Biol. 27 (24), 8502-8509 (2007).
- Sykes, S. M., et al. Acetylation of the p53 DNA-binding domain regulates apoptosis induction. Mol Cell. 24 (6), 841-851 (2006).
- Tang, Y., Luo, J., Zhang, W., Gu, W. Tip60-dependent acetylation of p53 modulates the decision between cell-cycle arrest and apoptosis. Mol Cell. 24 (6), 827-839 (2006).
- Chen, G., Cheng, Y., Tang, Y., Martinka, M., Li, G. Role of Tip60 in human melanoma cell migration, metastasis, and patient survival. J Invest Dermatol. 132 (11), 2632-2641 (2012).
- Gorrini, C., et al. Tip60 is a haplo-insufficient tumour suppressor required for an oncogene-induced DNA damage response. Nature. 448 (7157), 1063-1067 (2007).
- Jha, S., et al. Destabilization of TIP60 by human papillomavirus E6 results in attenuation of TIP60-dependent transcriptional regulation and apoptotic pathway. Mol Cell. 38 (5), 700-711 (2010).
- Kim, J. H., et al. Transcriptional regulation of a metastasis suppressor gene by Tip60 and beta-catenin complexes. Nature. 434 (7035), 921-926 (2005).
- Sakuraba, K., et al. Down-regulation of Tip60 gene as a potential marker for the malignancy of colorectal cancer. Anticancer Res. 29 (10), 3953-3955 (2009).
- Subbaiah, V. K., et al. E3 ligase EDD1/UBR5 is utilized by the HPV E6 oncogene to destabilize tumor suppressor TIP60. Oncogene. , (2015).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Zijl, F., Krupitza, G., Mikulits, W. Initial steps of metastasis: cell invasion and endothelial transmigration. Mutat Res. 728 (1-2), 23-34 (2011).
- Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 178-196 (2014).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
- Zhang, Y., et al. TIP60 inhibits metastasis by ablating DNMT1-SNAIL2-driven epithelial-mesenchymal transition program. J Mol Cell Biol. , (2016).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
- Jonkman, J. E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).
