כאן, אנו מציגים את ניטור בזמן אמת של נדידת תאים בשיטת ריפוי פצע באמצעות תאי האפיתל של השד מדולדל TIP60 MCF10A. היישום של טכניקות הדמיה לחיות תאים בפרוטוקול שלנו מאפשר לנו נתח והמחש תא בודד תנועה בזמן אמת ולאורך זמן.
ריפוי פצע וזמינותו יעיל ואחת הדרכים החסכונית ביותר ללמוד תא העברה בתוך חוץ גופית. כמקובל, תמונות נלקחים ב ההתחלה ואת הסוף של ניסוי בעזרת מיקרוסקופ שלב-ניגודיות, היכולות ההעברה של תאים מוערכות על-ידי סגירת פצעי. עם זאת, תנועת התא הוא תופעה דינמית, שיטה המקובלת אינה מאפשרת מעקב אחר תנועה תא בודד. כדי לשפר את מבחני ריפוי פצע הנוכחי, אנו משתמשים בטכניקות הדמיה לחיות תאים לעקוב אחר נדידת תאים בזמן אמת. שיטה זו מאפשרת לנו לקבוע את קצב ההעברה תא מבוססת על תא מערכת מעקב ומספק הבחנה ברורה בין נדידת תאים והתפשטות תאים. . הנה, נדגים את השימוש הדמיה לחיות תאים של ריפוי פצע מבחני ללמוד על היכולות ההעברה שונה של תאי אפיתל כנגד השד מושפע הנוכחות של TIP60. כמו תא תנועתיות הוא דינמי מאוד, השיטה שלנו מספק יותר תובנות תהליכי ריפוי מאשר תמונה של סגירת הפצע שצולמו באמצעות טכניקות הדימות המסורתי המשמש עבור מבחני ריפוי פצע הפצע.
HIV-טאט-אינטראקטיבי חלבון 60 kDa (TIP60) הוא acetyltransferase ליזין זה יכול acetylate היסטון והן הלא-היסטון חלבונים1,2. הפונקציות שלה נמצאים יש השלכות במשעולים איתות מרובים, כולל תמלול, תיקון נזק לדנ א של אפופטוזיס1,3,4,5,6, 7 , 8. יתר על כן, TIP60 הוא לרוב downregulated ב סרטן, ואת downregulation שלו הוא מתואם עם גרורות סרטן,9,10,11,12, שיעורי ההישרדות המסכן 13,14. גרורות הגידול הוא הגורם העיקרי של מוות מסרטן. זהו תהליך רב שלבי, השלב הראשוני של גרורות מערבת את ההעברה ואת הפלישה של תאים סרטניים לתוך לרקמות סמוכות15,16. לשם כך, תאים סרטניים תחילה יש לנתק בין המוני הגידול העיקרי, גם בצורה של גיליון תא קולקטיבי הפולש או כמו מנותק תאים בודדים17. במהלך תהליך זה, תאים סרטניים לעתים קרובות עוברים אפיתל המעבר mesenchymal (אמבולנס), וכתוצאה מכך לשינויים מורפולוגיה ותא אדהזיה יכולת17,18.
כמה טכניקות פותחו כדי ללמוד את ההעברה, הפלישה יכולת גידול של תאי במבחנה. ביניהם, וזמינותו ריפוי פצע הוא הכי יעיל וחסכוני19. ראשית, שיטה זו כרוכה היצירה של הפער המלאכותי טפט confluent של תאים, ובכך מאפשר לתאים להעביר ולסגור את הפער. שנית, ניתן ללכוד תמונות של הפערים-ההתחלה ואת הסוף של הניסוי. לבסוף, השוואה של סגירת הפער משמש כדי לקבוע את הקצב של נדידת תאים. מיקרוסקופ שלב-ניגודיות משמש בדרך כלל כדי ללכוד תמונות עבור קונבנציונאלי מבחני ריפוי פצע. יתרון נוסף של ריפוי פצע וזמינותו היא כי חלקית דומה ויוו נדידת תאים סרטניים. באופן דומה ל ויוו גרורות הגידול, נדידת תאים במבחני ריפוי פצע מציג את ההעברה קולקטיבית של גיליונות אפיתל והן את ההעברה של תאים בודדים מנותקת.
עם זאת, נדידת תאים ידוע להיות דינמי, יש צורך לתעד את התנועה של תאים בזמן אמת. למשל, וזמינותו המקובלת ריפוי פצע אינו מאפשר חוקר לנתח את התנועה תא בודד. מצד שני, תאים תרבותי עבור מבחני ריפוי פצע לעיתים קרובות מורעבים סרום כדי לעכב את התפשטות תאים. זה נעשה כדי לשלול את האפשרות של סגירת הפער עקב התפשטות תאים. למרות זאת, עדיין יהיו כמה התפשטות מוות תאי ואת שלב-ניגודיות מתמונות שצולמו לפני ואחרי הניסוי אינם מסוגלים להבחין ביניהם.
טכניקת דימות לחיות תאים מטפל ם קונבנציונאלי מבחני ריפוי פצע. באמצעות מיקרוסקופ הדמיה לחיות בשילוב עם CO2 החממה ואת בקרת הטמפרטורה המתאימה, חוקרים יכולים למדוד את גודל הפער, את קצב סגירת לאורך זמן תוך מעקב תנועת פעיל העברת תאים הממוקם בקצות חזית פולשני. לפיכך, המימוש של תאים חיים הדמיה לעקוב אחר נדידת תאים לא נספק רק כדי שתראי טוב יותר של נדידת תאים, אך יאפשר גם את האפשרות להבחין בין נדידת תאים והתפשטות תאים, ובכך מספק יותר ניתוח אמין של נדידת תאים.
במחקר זה, לתאי האפיתל של השד MCF10A שימשו כדי להדגים את השילוב של ריפוי פצע assay, תאים חיים הדמיה כדי לחקור את התפקיד של TIP60 ב נדידת תאים. דלדול של TIP60 תוצאות יכולות העברה מוגברת בתאי MCF10A.
זה ידוע כי בתהליך נדידת תאים, התאים יכול ולהעביר בצורה של חסיד גיליונות; אשכולות חופשי; או תאים בודדים, מבודדים. מצב ואת הדינמיקה של הפלישה תא יכול להשתנות ממצב אחד למשנהו, ולשנות פנוטיפ בתוך שעות. וזמינותו ריפוי פצע המסורתית מבוססת על תמונה תמונות שנלקחו מיקרוסקופ עם מרווח זמן, כגון 12 או 24 ?…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים חברי המעבדה Jha דיון מועיל וההערות שלהם. סניף נתמך על ידי מענקים קרן מחקר נבחרת סינגפור, סינגפור משרד החינוך תחת שלו מרכזי מחקר ביוזמת מצוינות סרטן המדע מכון של סינגפור (R-713-006-014-271), נבחרת רפואי מועצת המחקר (CBRG-כוש; BNIG11nov001 ו CS-IRG; R-713-000-162-511), קרן מחקר אקדמי משרד החינוך (T1 AcRF Tier 1 מו-2012 Oct -04). Y.Z., G.S.C. ו- C.Y.T. נתמכו על ידי מלגת תואר שני הוענק על ידי סרטן המדע מכון של סינגפור, באוניברסיטה הלאומית של סינגפור.
MCF10A cell | ATCC | CRL-10317TM | Breast epithelial cell |
DMEM/F12 media (1:1) | Gibco | 11330-032 | MCF10A culture media |
Epithelial growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Supplements for MCF10A culture media |
Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C-8052 | Supplements for MCF10A culture media |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-0888 | Supplements for MCF10A culture media |
Insulin | Sigma-Aldrich | I-1882 | Supplements for MCF10A culture media |
House serum | Gibco | 16050-122 | Supplements for MCF10A culture media |
Trypsin | Gibco | 25200-056 | For MCF10A detach from plate |
Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | For counting cell |
Opti-MEM reduced serum media | Gibco | 31985-070 | For siRNA mixture |
Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen/Life Technologies | 56532 | Transfect reagent |
Trizol reagent | Invitrogen/Life Technologies | 15596-026 | For mRNA extraction |
iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8891 | For cDNA generation |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5125 | For real time qPCR |
7500 Fast Real Time PCR system | Biosystems | Real time qPCR mechine | |
10-cm dish | Greiner bio-one | 664160 | For Knockdown experiment |
24-well plate | Cellstar | 662160 | For wound healing assay |
siControl siRNA | Self designed | Self designed | CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT |
siTIP60 siRNA | Self designed | Self designed | UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT |
Live cell observer | Zeiss | Zeiss inverted Cell Observer for live cell experiments |