Estabelecimento de dupla resistência de EGFR-TKI e conheci-TKI em Lung Adenocarcinoma células In Vitro com um procedimento passo-2 Dose-escalada
Summary
É descrito um método em vitro para estabelecer a resistência dupla para um EGFR-TKI e uma MET-TKI em células cancerosas. Este método é útil para o desenvolvimento de tratamentos para pacientes com EGFR-mutações, que apresentam progressão da doença apesar do tratamento de EGFR-TKI com MET-amplificação. Ele também pode ser modificado por inibidores como alvo outras moléculas.
Abstract
Resistência às drogas é um grande desafio na terapia do câncer. A geração de sublines resistente em vitro é necessária para descobrir novos mecanismos para superar este desafio. Aqui, um método de dose de 2-passo-escalada para estabelecer dual-resistência para um receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR)-inibidor de tirosina quinase (TKI), gefitinib e uma MET-TKI, PHA665752, é descrito. Este método é baseado na simples dose-escalada gradual de inibidores para induzir adquiriu resistência em linhas celulares. O método alternativo para a geração de sublines resistentes envolve expor as células para altas concentrações do inibidor em uma única etapa. O método de dose-escalada gradual tem uma maior possibilidade de sucesso induzindo adquiriu resistência do que esse método. Ativando o EGFR mutações são biomarcadores da resposta ao tratamento com EGFR-TKI, que é um tratamento de primeira linha aplicado para cânceres de pulmão não-pequenas células (NSCLC) que hospedam essas mutações. No entanto, apesar dos relatos de respostas eficazes, o uso de EGFR-TKI é limitado porque tumores inevitavelmente adquirem resistência. Os principais mecanismos por trás da resistência do EGFR-TKI incluem uma mutação secundária no local o porteiro, T790M no exon 20 de EGFR e um sinal de desvio de MET. Assim, uma potencial solução para esse problema seria uma combinação de EGFR-TKI e MET-TKI. Este tratamento combinado tem demonstrado ser eficaz em um modelo de estudo in vitro . Gefitinib-resistência adquirida foi estabelecida por meio de amplificação da MET por dose-escalada gradual de gefitinib por 12 meses, e uma linha de celular chamada PC-9MET1000 foi gerada em um estudo anterior. Para investigar os mecanismos da MET-TKI adquirida e EGFR-TKI resistência, um MET-TKI, PHA665752, foi administrada para estas células com dose-escalada gradual na presença de gefitinib por 12 meses. Este protocolo também foi aplicado com êxito para um número de terapias de combinação para estabelecer a resistência adquirida de outras moléculas de inibidor.
Introduction
Oncogênicas mutações no receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) encontram-se em um subconjunto dos pacientes com câncer de pulmão não-pequenas células (NSCLC) e são importantes biomarcadores preditivos desta doença1,2. Estas ativando mutações do EGFR mais comumente ocorrem como uma exclusão em-frame no exon 19 (delE746-A750) ou uma mutação de ponto substituindo leucina com arginina no códon 858 da exon 21 (L858R) no EGFR tirosina quinase domínio3,4. O tratamento com inibidores de EGFR-tirosina quinase (TKIs) é uma terapia clinicamente eficaz para pacientes com NSCLC abrigando mutações do EGFR. No entanto, esta terapia é limitada pela inevitável aquisição da resistência ao EGFR-TKIs como gefitinib e erlotinib. A resistência adquirida mais comum ocorre através de uma mutação T790M secundária no exon 20 EGFR, que foi detectado em aproximadamente 60% dos pacientes que adquiriram resistência de EGFR-TKI (gefitinib ou erlotinib). Outros mecanismos moleculares associados a resistência adquirida para EGFR-TKIs são ativação de sinalização de desvio causado pela amplificação do MET, transformação de cânceres de pulmão de pequenas células e epiteliais e mesenquimais transição5,6. O receptor para o fator de crescimento do hepatócito, codificado pelo gene MET, que é dysregulatedin muitos tumores, tem sido relatada a ser alvo de um importante candidato para terapias7,8.
Estratégias para superar a resistência adquirida para EGFR-TKIs agora estão passando por avaliação clínica. Estudos pré-clínicos e clínicos têm demonstrado que inibidores do EGFR de terceira geração como osimertinib são eficazes para pacientes com mutação T790M9. Além disso, o crescimento de cânceres de EGFR mutante com amplificação do MET pode ser inibido pelo tratamento combinado com TKIs EGFR – e MET6,10. Ensaios clínicos avaliando uma combinação de inibidores da MET e EGFR em pacientes com resistência adquirida ao gefitinib e erlotinib agora em curso são11.
Para estudar o mecanismo molecular de resistência adquirida aos agentes quimioterápicos, linhas celulares que inicialmente respondem aos inibidores são tratadas continuamente com estes inibidores. Dois métodos estão disponíveis para estabelecer a resistência adquirida em linhas celulares. Um é dose-escalada gradual, e o outro é a exposição de alta concentração. O método de escalonamento gradual tem sido mais comumente usado, porque tem uma maior taxa de sucesso. As células são primeiro expostas a baixas concentrações dos inibidores, quase um décimo do valor máximo meia concentração inibitória (IC50), e a concentração em seguida é aumentada gradualmente por 10-30% até que a concentração alvo é alcançada. O método de exposição de alta concentração envolve expor as células para a última dose do inibidor do meio de cultura, que é mais do que o valor de IC50 , para que as células parentais são quase completamente mortas. Este método de alta concentração de exposição tem muito uma menor taxa de sucesso do que o método de escalonamento em etapas.
Em um estudo anterior, tratamento combinado com EGFR-TKI e MET-TKI foi mostrado para ser eficaz em um sistema in vitro . Resistência adquirida a um TKI-EFGR, gefitinib, foi estabelecida por meio de escalada gradual por 12 meses, junto com a amplificação da MET, e assim, uma linhagem de células resistentes ao gefitinib chamada PC-9MET1000 foi gerado12.
O protocolo aqui apresentado é um procedimento de escalonamento de dose em duas etapas para a obtenção de uma mutação de EGFR NSCLC PC-9 células com dupla resistência para o EGFR-TKI, gefitinib e uma MET-TKI, PHA665752 (Figura 1). Esse método para o estabelecimento que adquiriu resistente em linhas celulares é relativamente fácil de realizar, com uma elevada taxa de sucesso. O protocolo descrito pode ser modificado para aplicação com inibidores de outras drogas de alvo molecular e agentes citotóxicos também.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo descrito aqui pode ser usado para o estabelecimento de dual-resistência adquirida nas células cancerosas, usando um método de dose de 2-passo-escalada em vitro. Muitas pesquisas têm relatado que o PC-9 células desenvolveram EGFR-TKI (gefitinib ou erlotinib) resistência através do EGFR T790M mutações15,16. No entanto, nós não detectar T790M mutações no exon 20 das nossas células de PC-9MET1000 por sequenciamento direto (<strong c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos os membros do Instituto de Oncologia Molecular para seus comentários pensativos e conselhos úteis e Editage por sua ajuda com a edição de língua inglesa. Este trabalho foi financiado pelo programa MEXT-suporte para a Fundação de pesquisa estratégica em universidades privadas (2012-2016) do Ministério da educação, cultura, esportes, ciência e tecnologia do Japão. Tohru Ohmori recebeu financiamento (2015-2016) da investigação da Boehringer-Ingelheim (Ingelheim, Alemanha).
Materials
| RPMI-1640 | Wako | 189-02025 | with L-Glutamine and Phenol Red |
| CellTiter 96 | Promega | G4100 | Non-Radioactive Cell Proliferation Assay |
| FBS | gibco | 26140-079 | |
| Pen Strep | gibco | 15140-163 | |
| gefitinib | Selleck | S1025 | stocked 10 mM/EMSO at -20ºC |
| PHA665752 | Selleck | S1070 | stocked 10 mM/EMSO at -20ºC |
| 96-well plate | IWAKI | 860-096 | flat bottom with lid, low evaporation type |
| TC10 Automated Cell Counter | BIO RAD | #1450010 | |
| CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay | Promega | G4100 | Dye Solution and Solubilization/Stop Solution |
| Powerscan HT microplate reader | BioTek | ||
| GraphPad Prism v.5.0 software | GraphPad Inc. | ||
| PC-9 | Riken BioResource Center | RCB4455 | |
| P100 dish | FALCON | 353003 |
References
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