מתוארת שיטה במבחנה להקמת התנגדות כפול של EGFR-TKI ו- MET-TKI בתאים סרטניים. שיטה זו שימושית לפיתוח טיפולים עבור חולים עם EGFR-מוטציות, אשר מוצג התקדמות המחלה למרות הטיפול EGFR-TKI עם MET-הגברה. זה גם יכול להיות שונה עבור מעכבי מיקוד מולקולות אחרות.
עמידות לתרופות היא אתגר גדול בטיפול בסרטן. הדור של sublines עמיד במבחנה הכרחי לגילוי מנגנונים חדשניים כדי להתגבר על האתגר הזה. הנה, שיטה 2-צעד המינון להקמת כפול-ההתנגדות קולטן גורם הגדילה באפידרמיס (EGFR)-מעכב טירוזין קינאז (TKI), אירסה, MET TKI, PHA665752, מתואר. שיטה זו מבוססת על פשוט stepwise המינון של מעכבי להשראת רכשה עמידות שורות תאים. השיטה החלופית ליצירת sublines עמיד כרוך חשיפת התאים ריכוזים גבוהים של המדכא בצעד אחד. לשיטה stepwise המינון גבוה יותר לאפשרות של גרימת בהצלחה רכשה התנגדות מאשר בשיטה זו. הפעלת EGFR מוטציות הם סמנים ביולוגיים של תגובה לטיפול עם EGFR-TKI, אשר הוא טיפול השורה הראשונה שימושית עבור סרטן ריאה מסוג תאים שאינם קטנים (NSCLC) זה הנמל מוטציות אלה. למרות דיווחים על תגובות אפקטיביות, השימוש של EGFR-TKI זאת, מוגבלת כי גידולים באופן בלתי נמנע לרכוש התנגדות. המנגנונים העיקריים מאחורי ההתנגדות EGFR-TKI כוללים מוטציה משני-האתר שומר הסף, T790M ב אקסון 20 של EGFR ו אות מעקף של המטרופוליטן. לכן, פתרון אפשרי לבעיה זו יהיה שילוב של EGFR-TKI MET-TKI. טיפול משולב זה הוכח כיעיל במודל במחקר במבחנה . אירסה-ההתנגדות רכשה הוקמה באמצעות MET-הגברה מאת stepwise המינון של אירסה ל-12 חודשים, קו תא בשם PC-9MET1000 נוצר במחקר הקודם. להמשיך לחקור את המנגנונים של המטרופוליטן נרכשת-TKI ו- EGFR-TKI ההתנגדות, MET-TKI, PHA665752, היה מנוהל תאים אלה עם stepwise המינון בנוכחות אירסה ל-12 חודשים. פרוטוקול זה גם יושם בהצלחה במשך מספר טיפולים משולבים להקים ההתנגדות רכשה מולקולות אחרות מעכב.
מוטציות oncogenic הקולטן גורם הגדילה באפידרמיס (EGFR) מצויים תת-קבוצה של חולים עם סרטן ריאות תאים שאינם קטנים (NSCLC), חשוב סמנים ביולוגיים חזוי של1,זו מחלה2. אלה מפעיל EGFR מוטציות הנפוצות מתרחשות מחיקה במסגרת ב אקסון 19 (delE746-A750) או מוטציה החלפת לאוצין עם ארגינין-codon 858 של אקסון 21 (L858R) ב- EGFR טירוזין קינאז תחום3,4. טיפול עם מעכבי EGFR-טירוזין קינאז (TKIs) הוא טיפול יעיל קלינית בחולים עם NSCLC מחסה EGFR מוטציות. עם זאת, טיפול זה מוגבל על ידי רכישת התנגדות EGFR-TKIs כגון אירסה טרסבה בלתי נמנע. ההתנגדות רכשה הנפוץ ביותר מתרחשת דרך מוטציה T790M משנית ב אקסון 20 של EGFR, אשר זוהה כ- 60% של חולים אשר רכשה EGFR-TKI (אירסה או טרסבה) התנגדות. מנגנונים מולקולריים אחרים הקשורים עם ההתנגדות רכשה EGFR-TKIs הם הפעלה של מעקף איתות הנגרמת על ידי הגברה MET, טרנספורמציה של סרטן ריאות תא-קטן, ואת המעבר אפיתל-אל-mesenchymal5,6. הקולטן עבור הגורם צמיחה hepatocyte, מקודדת על ידי הגן MET, אשר היא dysregulatedin גידולים רבים, דווחה להיות מועמד חשוב עבור ממוקד טיפולים7,8.
אסטרטגיות להתגברות על ההתנגדות רכשה EGFR-TKIs עוברים עכשיו הערכה קלינית. קליניים וקליניים הראו כי מעכבי EGFR דור שלישי כגון osimertinib יעילים בחולים עם מוטציה T790M9. בנוסף, הצמיחה של סרטן EGFR-מוטציה עם הגברה MET יכול להיות מעוכבים על ידי טיפול בשילוב עם EGFR – ו MET-TKIs6,10. ניסויים קליניים להערכת שילוב של מעכבי MET ו- EGFR בחולים עם ההתנגדות רכשה אירסה, טרסבה הן בעיצומן כעת11.
ללמוד את המנגנון המולקולרי של ההתנגדות רכשה סוכנים כימותרפיות, שורות תאים המגיבות בתחילה מעכבי מטופלים באופן רציף עם מעכבי אלה. שתי שיטות זמינות להקים ההתנגדות רכשה תא שורות. אחד הוא המינון stepwise, והשני הוא חשיפה גבוהה-ריכוז. השיטה הסלמה stepwise כבר יותר בשימוש נפוץ, כי יש לו שיעור הצלחה גבוה יותר. התאים נחשפים לראשונה ריכוזים נמוכים של מעכבי, כמעט עשירית ערך הריכוז המעכב חצי-מקסימלי (IC50), ואת הריכוז ואז גדל בהדרגה על ידי 10-30% עד ריכוז המטרה מושגת. שיטת חשיפה גבוהה-ריכוז כרוך חשיפת התאים המנה הסופית של מעכב במדיום תרבות, וזה יותר מהערך50 IC, כך התאים הורים נהרגים כמעט לחלוטין. שיטה זו חשיפה גבוהה-ריכוז יש הרבה קצב נמוך יותר הצלחה מאשר השיטה stepwise הסלמה.
במחקר הקודם, טיפול משולב עם EGFR-TKI MET-TKI הוצגה יעיל במערכת במבחנה . ההתנגדות רכשה EFGR-TKI, אירסה, הוקמה דרך הסלמה stepwise למשך 12 חודשים, יחד עם MET-הגברה, והיה לכן, קו תא עמידים אירסה שנקרא PC-9MET1000 שנוצר12.
פרוטוקול המובאת כאן היא הליך המינון שני שלבים להשגת מוטציה-EGFR NSCLC PC-9 תאים עם התנגדות כפול EGFR-TKI אירסה, MET TKI, PHA665752 (איור 1). שיטה זו להקמת רכשה עמיד בשורות תא יחסית קל לביצוע, עם אחוזי הצלחה גבוהים. ניתן לשנות את הפרוטוקול המתואר ליישום עם מעכבי של אחרים סמים היעד מולקולרית, וכן ציטוטוקסיות סוכנים.
הפרוטוקול המתואר כאן יכול לשמש להקמת כפול-ההתנגדות רכשה ב תאים סרטניים באמצעות השיטה של 2-צעד המינון חוץ גופית בתוך. עבודות מחקר רבות דיווחו כי PC-9 תאים פיתחו עמידות (אירסה או טרסבה) EGFR-TKI דרך T790M EGFR מוטציות15,16. עם זאת, אנחנו לא זיהה T790M מוטציות ב אקסון 20 תאי?…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים חברי המכון לאונקולוגיה מולקולרית מתחשב הערות, עצות מועילות, Editage לסיוע שלהם עם עריכה בשפה האנגלית. עבודה זו נתמכה על-ידי התוכנית הנתמכות על-ידי MEXT עבור קרן מחקר אסטרטגי באוניברסיטאות פרטי (2012-2016) מ משרד החינוך, תרבות, ספורט, מדע, טכנולוגיה של יפן. Tohru Ohmori קיבל מימון (2015-2016) המחקר Boehringer-Ingelheim (אוסטריה).
RPMI-1640 | Wako | 189-02025 | with L-Glutamine and Phenol Red |
CellTiter 96 | Promega | G4100 | Non-Radioactive Cell Proliferation Assay |
FBS | gibco | 26140-079 | |
Pen Strep | gibco | 15140-163 | |
gefitinib | Selleck | S1025 | stocked 10 mM/EMSO at -20ºC |
PHA665752 | Selleck | S1070 | stocked 10 mM/EMSO at -20ºC |
96-well plate | IWAKI | 860-096 | flat bottom with lid, low evaporation type |
TC10 Automated Cell Counter | BIO RAD | #1450010 | |
CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay | Promega | G4100 | Dye Solution and Solubilization/Stop Solution |
Powerscan HT microplate reader | BioTek | ||
GraphPad Prism v.5.0 software | GraphPad Inc. | ||
PC-9 | Riken BioResource Center | RCB4455 | |
P100 dish | FALCON | 353003 |