يتم وصف أسلوب في المختبر لإنشاء المقاومة المزدوج EGFR-TKI و MET TKI في الخلايا السرطانية. يعد هذا الأسلوب مفيداً لتطوير علاجات لمرضى EGFR-الطفرات، الذين يظهرون تطور المرض رغم العلاج EGFR TKI مع MET-التضخيم. فإنه يمكن أيضا تعديل لمثبطات استهداف الجزيئات الأخرى.
مقاومة المخدرات يشكل تحديا رئيسيا في علاج السرطان. جيل سوبلينيس مقاومة في المختبر اللازمة لاكتشاف آليات مبتكرة للتغلب على هذا التحدي. هنا، وأسلوب تصعيد جرعة 2-خطوة لإنشاء المقاومة المزدوجة لمستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR)-تيروزين كيناز المانع (TKI) وجيفيتينيب MET TKI، PHA665752، هو وصف. يستند هذا الأسلوب إلى بسيطة تصعيد الجرعة التدريجي من مثبطات لحفز اكتسبت المقاومة في خطوط الخلايا. أسلوب بديل لتوليد سوبلينيس مقاومة ينطوي على تعريض الخلايا لتركيزات عالية من المانع في خطوة واحدة. يحتوي الأسلوب على تصعيد الجرعة تدريجي أعلى إمكانية نجاح حمل اكتسبت مقاومة من هذا الأسلوب. تفعيل EGFR الطفرات هي المؤشرات الحيوية لاستجابة للعلاج مع EGFR-TKI، الذي هو علاج الخط الأول تطبيقية لسرطان الرئة الخلية غير الصغيرة (NSCLC) التي تأوي هذه الطفرات. على الرغم من تقارير استجابات الفعالة، استخدام EGFR TKI غير محدودة نظراً لأن الأورام حتما اكتساب المقاومة. وتشمل الآليات الرئيسية وراء المقاومة EGFR TKI طفرة ثانوية في موقع برنامج حماية البوابة، T790M في إكسون 20 من EGFR، وإشارة تجاوز تابعين. وهكذا، حل محتمل لهذه المسألة سيكون مزيجاً من EGFR TKI و MET TKI. هذا العلاج مجتمعة قد ثبت أن تكون فعالة في نموذج دراسة في المختبر . أنشئت المقاومة جيفيتينيب المكتسبة من خلال التضخيم MET بتصعيد الجرعة تدريجي من جيفيتينيب لمدة 12 شهرا، وتم إنشاء خط خلية المسماة PC-9MET1000 في دراسة سابقة. لمواصلة التحقيق آليات TKI MET المكتسبة و EGFR TKI تدار المقاومة، MET-TKI، PHA665752، لهذه الخلايا مع تصعيد الجرعة تدريجي حضور جيفيتينيب لمدة 12 شهرا. هذا البروتوكول كما طبقت بنجاح لعدد من العلاجات المركبة إنشاء المقاومة المكتسبة لجزيئات مثبطات أخرى.
النمطان الطفرات في مستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR) وتوجد في مجموعة فرعية من المرضى الذين يعانون من سرطان الرئة الخلية غير الصغيرة (NSCLC) وهي المؤشرات الحيوية التنبؤية هامة من هذا المرض1،2. تحدث هذه تفعيل EGFR الطفرات الأكثر شيوعاً كحذف في الإطار في إكسون 19 في (delE746-A750) أو طفرة نقطة استبدال لوسين ارجينين في كودون 858 من إكسون 21 (L858R) في EGFR تيروزين كيناز المجال3،4. المعالجة بمثبطات كيناز تيروزين EGFR (تكيس) علاج فعال سريرياً لمرضى NSCLC إيواء الطفرات EGFR. ومع ذلك، يقتصر هذا العلاج لا مفر منه اكتساب المقاومة تكيس EGFR مثل جيفيتينيب وارلوتينيب. أن المقاومة المكتسبة الأكثر شيوعاً يحدث عن طريق طفرة T790M ثانوية في إكسون 20 من EGFR، التي تم الكشف عنها في حوالي 60% مرضى الذين اكتسبوا المقاومة EGFR TKI (جيفيتينيب أو ارلوتينيب). الآليات الجزيئية الأخرى المرتبطة بالمقاومة المكتسبة تكيس EGFR يتم تفعيل الالتفافية مما يشير إلى سبب التضخيم MET، التحول من سرطان الرئة الخلية الصغيرة، والمرحلة الانتقالية الظهارية للوسيطة5،6. المستقبلات لعامل النمو تتمثل، مرمزة بواسطة الجينات MET، الذي هو ديسريجولاتالدين العديد من الأورام، وقد أبلغ عن أن يكون مرشح مهم لاستهداف العلاجات7،8.
استراتيجيات للتغلب على المقاومة المكتسبة تكيس EGFR يجري الآن تقييم السريرية. الدراسات السريرية والسريرية أظهرت أن مثبطات EGFR الجيل الثالث مثل أوسيميرتينيب فعالاً بالنسبة للمرضى الذين يعانون من الطفرة T790M9. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تحول دون نمو السرطانات EGFR-المسخ مع التضخيم MET بالجمع بين العلاج مع تكيس EGFR ويلتقي6،10. التجارب السريرية تقييم تركيبة من مثبطات MET و EGFR في المرضى مع المقاومة المكتسبة إلى جيفيتينيب وارلوتينيب جارية الآن11.
لدراسة الآلية الجزيئية للمقاومة المكتسبة لوكلاء العلاج الكيميائي، وخطوط الخلايا التي تستجيب في البداية لمثبطات تعامل بشكل مستمر مع هذه الموانع. تتوفر طريقتين إنشاء المقاومة المكتسبة في خطوط الخلايا. واحد تصعيد الجرعة تدريجي، والآخر هو التعرض لتركيزات عالية. أسلوب تصعيد تدريجي وقد تم أكثر شيوعاً، لأنه يحتوي على معدل نجاح أعلى. أولاً تتعرض الخلايا بتركيزات منخفضة من مثبطات، حوالي عشر قيمة النصف الأعلى تركيز المثبطة (IC50)، والتركيز ثم يتم تدريجيا زيادة بنسبة 10-30% حتى يتم تحقيق تركيز الهدف. يتضمن أسلوب التعرض لتركيزات عالية من تعريض الخلايا للجرعة النهائية من مثبط على المديين المتوسط والثقافة، التي أكثر من قيمة50 IC، حيث قتل الخلايا الأبوية تماما تقريبا. يحتوي هذا الأسلوب التعرض لتركيزات عالية من معدل نجاح أقل كثيرا من أسلوب التصعيد التدريجي.
في دراسة سابقة، كان سيظهر العلاج مجتمعة مع EGFR TKI ويلتقي TKI أن تكون فعالة في نظام في المختبر . المقاومة المكتسبة لافجر-TKI، جيفيتينيب، أنشئ من خلال تصعيد تدريجي لمدة 12 شهرا، جنبا إلى جنب مع MET-التضخيم، وهكذا، كان خط خلية جيفيتينيب مقاوم يسمى PC-9MET1000 الذي تم إنشاؤه12.
البروتوكول المعروضة هنا إجراء تصعيد جرعة خطوتين للحصول على خلايا تحور EGFR NSCLC PC-9 مع المقاومة المزدوج EGFR-TKI وجيفيتينيب MET TKI، PHA665752 (الشكل 1). هذا الأسلوب لإنشاء المكتسبة مقاومة في خطوط الخلايا سهلة نسبيا لتنفيذ، مع ارتفاع نسبة نجاح. يمكن تعديل البروتوكول وصف التطبيق مع مثبطات للعقاقير الجزيئية المستهدفة والعوامل السامة للخلايا، فضلا عن الأخرى.
يمكن استخدام البروتوكول هو موضح هنا لإنشاء المقاومة المزدوجة المكتسبة في الخلايا السرطانية باستخدام أسلوب تصعيد جرعة 2-الخطوة في المختبر. وأفادت العديد من الورقات البحثية أن تطوير PC-9 خلايا المقاومة EGFR TKI (جيفيتينيب أو ارلوتينيب) من خلال T790M EGFR الطفرات15،16</…
The authors have nothing to disclose.
ونشكر أعضاء معهد علم الأورام الجزيئي للتعليقات المدروسة ونصائح مفيدة، واديتاجي لمساعدتها مع تحرير اللغة الإنجليزية. وأيد البرنامج يدعم يأمرون هذا العمل “مؤسسة الأبحاث الاستراتيجية” في الجامعات الخاصة (2012-2016) من وزارة التربية والتعليم، والثقافة والرياضة، والعلوم والتكنولوجيا في اليابان. أوموري توهرو تلقي أبحاث التمويل (2015-2016) من بورنغير-انغلهايم (انغلهايم، ألمانيا).
RPMI-1640 | Wako | 189-02025 | with L-Glutamine and Phenol Red |
CellTiter 96 | Promega | G4100 | Non-Radioactive Cell Proliferation Assay |
FBS | gibco | 26140-079 | |
Pen Strep | gibco | 15140-163 | |
gefitinib | Selleck | S1025 | stocked 10 mM/EMSO at -20ºC |
PHA665752 | Selleck | S1070 | stocked 10 mM/EMSO at -20ºC |
96-well plate | IWAKI | 860-096 | flat bottom with lid, low evaporation type |
TC10 Automated Cell Counter | BIO RAD | #1450010 | |
CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay | Promega | G4100 | Dye Solution and Solubilization/Stop Solution |
Powerscan HT microplate reader | BioTek | ||
GraphPad Prism v.5.0 software | GraphPad Inc. | ||
PC-9 | Riken BioResource Center | RCB4455 | |
P100 dish | FALCON | 353003 |