Doppelte Resistenz gegen EGFR-TKI und traf TKI etablieren in Lunge Adenokarzinom Zellen In Vitro mit einem 2-stufigen Dosiseskalation Verfahren
Summary
Eine in-vitro- Methode für die Festlegung der doppelten Widerstand gegen eine EGFR-TKI und ein MET-TKI in Krebszellen wird beschrieben. Diese Methode ist nützlich für die Entwicklung von Therapien für Patienten mit EGFR-Mutationen, die Progression der Erkrankung trotz der EGFR-TKI Behandlung mit MET-Verstärkung ausstellen. Es kann auch für Inhibitoren gezielt andere Moleküle geändert werden.
Abstract
Arzneimittel-Resistenz ist eine große Herausforderung in der Krebstherapie. Die Generation der resistenten Verwandte in Vitro ist notwendig für die Entdeckung neuartiger Mechanismen, um diese Herausforderung zu meistern. Hier, eine 2-stufige Dosiseskalation Methode zur Ermittlung von Dual-Widerstand gegen eine epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR)-Tyrosin-Kinase-Inhibitor (TKI), Gefitinib und MET-TKI, PHA665752, beschrieben. Diese Methode basiert auf einfachen schrittweisen Dosissteigerung von Inhibitoren zur Induktion erworbene Resistenz in Zell-Linien. Die alternative Methode zur Erzeugung von resistenten Verwandte beinhaltet Freilegung der Zellen zu hohe Konzentrationen des Inhibitors in einem Schritt. Die schrittweise Dosissteigerung Methode hat eine höhere Möglichkeit erfolgreich induzieren erworbene Resistenz als diese Methode. Aktivierung des EGFR sind Mutationen Biomarker für ein Ansprechen auf die Behandlung mit EGFR-TKI, eine angewandte First-Line Behandlung für nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC), die diese Mutationen zu beherbergen. Jedoch beschränkt sich trotz Berichte über wirksame Lösungen, die Verwendung von EGFR-TKI weil Tumoren zwangsläufig Widerstand erwerben. Die wichtigsten Mechanismen hinter EGFR-TKI-Resistenz gehören eine sekundäre Mutation bei der Gatekeeper-Website, T790M im Exon 20 des EGFR und ein Bypass-Signal von MET. Somit wäre eine mögliche Lösung für dieses Problem eine Kombination von EGFR-TKI und MET-TKI. Diese Kombinationsbehandlung hat sich gezeigt, wirksam in einem in-vitro- Studienmodell sein. Erworbener Gefitinib-Resistenz wurde durch MET-Verstärkung durch schrittweise Dosissteigerung von Gefitinib für 12 Monate und eine Zell-Linie namens PC-9MET1000 wurde in einer früheren Studie generiert. Um weiter zu untersuchen, die Mechanismen der erworbenen MET-TKI und EGFR-TKI war Widerstand, ein MET-TKI, PHA665752, diese Zellen mit schrittweiser Dosissteigerung in Anwesenheit von Gefitinib für 12 Monate verabreicht. Dieses Protokoll wurde auch für eine Reihe von Kombinationstherapien erworbenen Resistenz gegen andere Hemmer Moleküle herstellen erfolgreich angewendet.
Introduction
Onkogene Mutationen in den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) befinden sich in einer Untergruppe von Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) und sind wichtige Prädiktive Biomarker von dieser Krankheit1,2. Diese Aktivierung EGFR-Mutationen am häufigsten auftreten, entweder als ein in-Frame löschen im Exon 19 (delE746-A750) oder einer Punktmutation Leucin durch Arginin an Codon 858 Exon 21 (L858R) in der EGFR Tyrosin-Kinase-Domäne3,4zu ersetzen. Behandlung mit EGFR-Tyrosin-Kinase-Inhibitoren (TKIs) ist eine klinisch wirksame Therapie für Patienten mit NSCLC beherbergen EGFR-Mutationen. Allerdings ist diese Therapie durch den unvermeidlichen Erwerb des Widerstandes gegen EGFR-TKIs wie Gefitinib und Erlotinib begrenzt. Die häufigste erworbene Resistenz tritt durch eine sekundäre T790M-Mutation im Exon 20 des EGFR, die bei etwa 60 % der Patienten festgestellt wurde, die EGFR-TKI (Gefitinib oder Erlotinib) Resistenz erworben. Andere molekulare Mechanismen erworbene Resistenz gegen EGFR-TKIs sind Aktivierung der Bypass Signalisierung verursacht durch MET Amplifikation, Umwandlung von kleinzelligem Lungenkrebs und epitheliale-mesenchymale Transition5,6. Der Rezeptor für den Hepatozyten-Wachstumsfaktor von MET-Gen kodiert die Dysregulatedin viele Tumoren, wurde berichtet, werden ein wichtiger Kandidat für gezielte Therapien7,8.
Strategien zur Überwindung der erworbenen Resistenz gegen EGFR-TKIs sind jetzt klinische Bewertung unterzogen. Präklinische und klinische Studien haben gezeigt, dass für Patienten mit T790M Mutation9Dritterzeugung EGFR-Inhibitoren wie Osimertinib funktionieren. Darüber hinaus kann das Wachstum der EGFR-mutierten Tumoren mit MET Verstärkung durch Kombinationsbehandlung mit EGFR und MET TKIs6,10gehemmt werden. Klinische Studien, die eine Kombination von MET und EGFR-Inhibitoren bei Patienten mit einer erworbenen Resistenz gegen Gefitinib und Erlotinib Beurteilung sind im Gange jetzt11.
Um den molekularen Mechanismus der erworbenen Resistenz gegen Chemotherapeutika zu untersuchen, werden kontinuierlich Zelllinien, die zunächst auf Inhibitoren reagieren mit dieser Inhibitoren behandelt. Zwei Methoden zur Verfügung, erworbenen Resistenz in Zelllinien zu etablieren. Ist eine schrittweise Dosissteigerung und die andere ist hoher Konzentration ausgesetzt. Die schrittweise Eskalation-Methode wurde häufiger eingesetzt, weil es eine höhere Erfolgsquote hat. Die Zellen zunächst geringen Konzentrationen der Inhibitoren, fast ein Zehntel des Konzentrationswertes der Hälfte-maximale inhibitorischen (IC50), ausgesetzt sind und die Konzentration wird dann schrittweise um 10-30 % erhöht, bis die Zielkonzentration erreicht wird. Hoher Konzentration Belichtungsmethode beinhaltet Freilegung der Zellen, die letzte Dosis von Inhibitor in das Kulturmedium, das ist mehr als der IC50 Wert, also die elterliche Zellen fast vollständig abgetötet werden. Diese hohe Konzentration Belichtungsmethode hat viel eine niedrigere Erfolgsrate als die schrittweise Eskalation-Methode.
In einer früheren Studie zeigte Kombinationsbehandlung mit EGFR-TKI und MET-TKI in einem in Vitro -System wirksam. Erworbener Resistenz gegen eine EFGR-TKI, Gefitinib, entstand durch schrittweise Eskalation für 12 Monate, zusammen mit MET-Verstärkung, und so war eine Gefitinib-resistenten Zellinie namens PC-9MET1000 generierten12.
Die hier vorgestellten Protokoll ist ein zweistufiges Dosiseskalation Verfahren für den Erhalt der EGFR-mutierten NSCLC PC-9 Zellen mit doppelten Widerstand gegen EGFR-TKI, Gefitinib und MET-TKI, PHA665752 (Abbildung 1). Diese Methode zur Einrichtung erworben in Zelllinien resistent ist relativ einfach durchzuführen, mit einer hohen Erfolgsquote. Das beschriebene Protokoll kann für Anwendung mit Inhibitoren von anderen molekularen Ziel Drogen und Zytostatika sowie geändert werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Protokoll kann für die Einrichtung der erworbenen Dual-Resistenz in Krebszellen mit einer 2-stufigen Dosiseskalation Methode in Vitroverwendet werden. Viele Forschungsarbeiten haben berichtet, dass PC-9 Zellen EGFR-TKI (Gefitinib oder Erlotinib) Widerstand durch T790M EGFR-Mutationen-15,–16entwickelt. Allerdings wir nicht T790M Mutationen im Exon 20 unserer PC-9MET1000-Zellen durch direkte Sequenzierung (Abbild…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken die Mitgliedern des Instituts für Molekulare Onkologie für ihre nachdenklichen Kommentaren und hilfreiche Ratschläge und Editage für ihre Unterstützung mit englischer Sprache bearbeiten. Diese Arbeit wurde von MEXT-unterstütztes Programm für strategische Forschungsgemeinschaft an privaten Hochschulen (2012-2016) vom Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie in Japan unterstützt. Tohru Ohmori erhielt Forschungsförderung (2015-2016) von Boehringer-Ingelheim (Ingelheim, Deutschland).
Materials
| RPMI-1640 | Wako | 189-02025 | with L-Glutamine and Phenol Red |
| CellTiter 96 | Promega | G4100 | Non-Radioactive Cell Proliferation Assay |
| FBS | gibco | 26140-079 | |
| Pen Strep | gibco | 15140-163 | |
| gefitinib | Selleck | S1025 | stocked 10 mM/EMSO at -20ºC |
| PHA665752 | Selleck | S1070 | stocked 10 mM/EMSO at -20ºC |
| 96-well plate | IWAKI | 860-096 | flat bottom with lid, low evaporation type |
| TC10 Automated Cell Counter | BIO RAD | #1450010 | |
| CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay | Promega | G4100 | Dye Solution and Solubilization/Stop Solution |
| Powerscan HT microplate reader | BioTek | ||
| GraphPad Prism v.5.0 software | GraphPad Inc. | ||
| PC-9 | Riken BioResource Center | RCB4455 | |
| P100 dish | FALCON | 353003 |
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