Segmental adeno-cre enfeksiyonu ile genetik olarak tasarlanmış kolorektal kanserli fare modeli kurulması ve yüksek çözünürlüklü kolonoskopi ile gözlemlenmesi için bir protokol sunulmuştur.
Kolay uygulanabilirlik ve maliyet etkinliğinin avantajlarına rağmen, tümör hücresi enjeksiyonuna dayanan kolorektal kanserli fare modelleri ciddi sınırlamalara sahiptir ve tümör biyolojisi ve tümör hücresi yayılımını doğru şekilde simüle etmez. Genetik olarak tasarlanmış fare modelleri bu sınırlamaların üstesinden gelmek için sunulmuştur; Bununla birlikte, bu tür modeller, özellikle tek bir tümörün arzulanan kolon gibi büyük organlarda teknik olarak talep edilmektedir.
Sonuç olarak, oldukça uyumlu tümörler geliştiren ve tümör biyolojisi çalışmaları ve terapötik denemeler için kullanılabilen, bağışıklık kazandırıcı, genetik olarak tasarlanmış kolorektal kanserli fare modeli geliştirildi. Tümör gelişimi, bileşik koşullu mutant farelerde distal kolonun adeno-cre virüsü ile cerrahi, segmental enfeksiyonu ile başlatılır. Kolonoskopi ile tümörler kolayca tespit edilebilir ve izlenebilir. Burada segmental adeno-cre enfeksiyonunun cerrahi tekniğini tanımlıyoruzKolon, yüksek çözünürlüklü kolonoskopi ile tümörün gözetimi ve oluşan kolorektal tümörler.
Kolorektal kanser (ÇHS), batı ülkelerinde kansere bağlı ölümlerin başlıca nedenlerinden biri olmayı sürdürüyor. Erken evre hastalığı olan hastaların prognozu iyi olmakla birlikte, birçok tedavi seçeneği olmasına rağmen prognozu sınırlı olan sonraki aşamalarda birçok tümör tanısı konur. 2 , 3 , 4 , 5
Mevcut CRC fare modellerinin çoğunluğu, hücre hatlarından veya hasta tümörlerinden türetilen tümör hücrelerinin immün yetersiz farelere implante edilmesine dayanır. 6 , 7 , 8 Bu, lokal yol açar ve enjeksiyon yerine ve enjeksiyon için kullanılan tümör hücrelerine bağlı olarak, bazen metastatik tümörler oluşturur. Ancak, ortaya çıkan xenograft modelleri majo'yduSınırlamaları. Bağışıklık eksikliği olan farelerde kurulmalılar, böylece tümör ve bağışıklık sistemi arasındaki karmaşık etkileşim ortadan kaldırılmalıdır. Buna ek olarak, tümör stroması konukçu hücrelerden türetildiğinde, insan tümörü parankimi ile mürin stroması arasındaki etkileşim kusurludur ve bu nedenle hastalığı temsil etmez. Bu eksiklikler, enjeksiyon için fare hücre dizilerinin kullanımı ile engellenebilir. Bununla birlikte, sadece birkaç fare CRC hücre çizgisi mevcuttur ve en çok bulunan insan CRC hücre çizgilerine benzer şekilde, monoklonal ve oldukça anaplastiktir. Özetle, halihazırda mevcut CRC fare modellerinin çoğu yapaytır ve insan hastalığını tam olarak temsil etmez.
CRC'nin genetik olarak tasarlanmış fare modelleri (GEMM'ler), bu iki dezavantajdan kaçınılabildikleri için kolondaki CRC'nin anahtar mutasyonlarının indüksiyonu yoluyla oluşturulan gerçek fare tümörleri özelliği taşırlar. 12 , 13 ,14 Bu, kolorektal mukozadaki kreatin recombinaz tarafından koşullu (ökelenmiş) tohum çizgisi mutasyonlarının aktivasyonu ile başarılabilir. Diğer pek çok tümör varlıklarının GEMM'lerinde dokuya özgü hızlandırıcılar tarafından yönlendirilen germline (indüklenebilir) cre ifadesi kullanılırken, germline cre, kolondaki çok sayıda adenomaya yol açtığı için benign tümör yükü tarafından ölüm neden olur Çok genç yaş. Bu nedenle, burada tarif edilen modelde, cre'yi ifade eden bir adenoviral vektör kısa bir kolon segmentini enfekte etmek için kullanılır. Bu, araştırmacı tarafından tanımlanan bir zaman noktasında, mukozanın bu segmenti içindeki tümörojenezin uyarılmasına yol açarak sonuçta invaziv ve metastatik karsinomaya ilerleyen adenomlarla sonuçlanır. Tümörler orijinal fare tümörleri olup bozulmamış bir mikro ortamda büyür ve bu nedenle tümör-konakçı etkileşimi ve metastatik kaskad da dahil olmak üzere kolorektal onkogenezin tamamını taklit edebilmektedir. Bu modelBu nedenle kanser biyolojisi ve klinik öncesi terapötik denemeler için çekici bir platform.
CRC'nin genetik olarak tasarlanmış fare modellerinin büyük bir dezavantajı teknik karmaşıklığıdır. Floxed Apc alelleri taşıyan farelerde rektal adeno-cre enema kullanan lokal cre doğum daha önce tanımlanmıştır; Bununla birlikte, bağırsak tümörlerinin insidansı, çokluğu ve lokalitesi, bu teknikle oldukça değişken olabilir. 15 Bu nedenle, adeno-cre enfeksiyonunun indüklenecek segmentin ameliyat klemplemesi ile sınırlandırılması tekniği geliştirilmiştir. 13 Bu prosedürü, hayvan refahını arttırmak için, ayrıca mortaliteyi ve ortaya çıkan tümör sayısını azaltmak için değiştirdik. Bu protokol ile, küçük kemirgen cerrahide deneyime sahip tüm laboratuarlar, modeli çoğaltmalı ve kolonoskopi için kolaylıkla erişilebilen ve oldukça tekrarlanabilir olan tümörler üretmelidir. Koşullu m'ye bağlı olarakTümörigenez için kullanılan utasyonlar, adenomun tam spektrumu, invaziv karsinom ve metastazlar gözlenebilir. Tümörler distal kolondaki konumundan dolayı bu modelde seri endoskopik değerlendirme kolayca mümkündür.
Genellikle üretilmesi ve bakımı kolay olsa da, hücre çizgisi enjeksiyonuna dayanan klasik CRC fare modelleri yapaytır ve insan hastalığını tam olarak tekrar edememektedir. Sonuç olarak GEMM'ler geliştirildi. İlk CRC GEMM, Apc geninde heterozigot boş bir mutasyona sahip Apc Min fare idi, bu nedenle insan kalıtsal hastalık ailevi adenomatöz polipozis (FAP) taklit eder. Bununla birlikte, Apc Min fare- lerinde her zaman kolond ile sınırlı olmayan çok sayıda bağırsak adenomu …
The authors have nothing to disclose.
Bu eser Prof. Moritz Koch'un anısına ithaf edilmiştir.
Reagents / consumables | |||
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
Trypsin-EDTA (0.25%, Phenol-Red) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
Normal saline 0.9% (E154) | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
Aqua ad injectabilia | B. Braun Melsungen AG | 235144 | |
Ad5CMV-Cre (adenovirus, c = 2E+11 PFU/mL) | Gene Transfer Vector Core University of Iowa |
||
15 mL, 50 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
Eppendorf tubes 1.5 mL/ 2 mL | Sarstedt AG & Co. | 72,695,400 | |
Petri dish PS 100/15 mm (sterile, Nuclon) | Fisher Scientific GmbH | 10508921/ NUNC150350 | |
1 mL Syringe (without dead volume) – Injekt-F SOLO | Braun/neoLab | 194291661 | |
30G injection needle | BECTON DICKINSON | 304000 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Analgesia / anesthesia | |||
Sevoflurane (Sevoflurane AbbVie) | AbbVie Germany GmbH & Co. KG | – | |
Medical oxygen | Air Liquide Medical GmbH | – | |
Buprenorphine (Temgesic) | Indivior Eu Ltd. | – | |
Bepanthen – ophthalmic ointment | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
Table Top Research Anesthesia Machine x/O2 Flush w/ Sevoflurane Vaporizer | Parkland Scientific | V3000PS/PK | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Surgical Equipment | |||
Cellulose swabs | Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | |
Insulin syringe EMG 1 mL (with 30G cannula) | B. Braun Melsungen AG | 9161627S | |
Fine Bore Tubing (bore: 0.28 mm/ diameter: 0.61mm) | Smiths Medical Deutschland | 800/100/100 | |
Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | |
Iris Scissor – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-11 | |
Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | 12002-12 | |
AutoClip Kit | Fine Science Tools | 12020-00 | |
PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
Curved Micro Serrefine Vascular Clamp | Fine Science Tools | 18055-05 | |
Fogarty Spring Clips | Edwards | CDSAFE 6 | |
Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
Isis – Hair shaver | Aesculap – Braun | – | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Colonoscopy | |||
Cold Light Fountain XENON 175 SCB | Karl Storz | 20132101-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
Fiber Optic Light Cable | Karl Storz | 69495NL | Karl Storz Coloview System Mainz |
TRICAM Three-Chip Camera Head | Karl Storz | 20221030 | Karl Storz Coloview System Mainz |
TRICAM SLII Camera Control Unit | Karl Storz | 20223011-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
15" Flat Screen Monitor EndoVue | Karl Storz | 9415NN | Karl Storz Coloview System Mainz |
HOPKINS Straight Forward Telescope diameter 1.9 mm; length 10 cm autoclavable fiber optic light transmission incorporated |
Karl Storz | 64301AA | |
Protection and Examination Sheath | Karl Storz | 61029C |