ويرد بروتوكول لإنشاء نموذج الفأر المهندسة وراثيا من سرطان القولون والمستقيم عن طريق العدوى الغدة اللحية القطاعية وترصدها عن طريق التنظير القولون عالية الدقة.
على الرغم من مزايا سهولة تطبيق وفعالية من حيث التكلفة، ونماذج الماوس سرطان القولون والمستقيم على أساس حقن الخلايا السرطانية لها قيود شديدة ولا محاكاة بدقة علم الأورام الورم ونشر الخلايا السرطانية. وقد أدخلت نماذج الفئران المهندسة وراثيا للتغلب على هذه القيود؛ ومع ذلك، فإن مثل هذه النماذج تتطلب من الناحية التقنية، وخاصة في الأجهزة الكبيرة مثل القولون الذي هو المطلوب فقط ورم واحد.
ونتيجة لذلك، تم تطوير نموذج مناعة، وراثيا نموذج الفأر من سرطان القولون والمستقيم الذي يتطور الأورام موحدة للغاية، ويمكن استخدامها لدراسات البيولوجيا الورم وكذلك التجارب العلاجية. يبدأ تطور الورم عن طريق العدوى الجراحية، القطاعية من القولون البعيدة مع فيروس الغدة كري في الفئران متحولة مشروط مجمع. الأورام يمكن الكشف عنها بسهولة ورصدها عن طريق تنظير القولون. نحن هنا وصف تقنية الجراحية من العدوى الغدة القطعي منوالقولون، ومراقبة الورم عن طريق تنظير القولون عالية الدقة وتقديم أورام القولون والمستقيم الناتجة.
لا يزال سرطان القولون والمستقيم (كرك) أحد الأسباب الرئيسية للوفاة المرتبطة بالسرطان في البلدان الغربية. 1 في حين أن تشخيص المرضى الذين يعانون من مرض المرحلة المبكرة هو جيد، يتم تشخيص العديد من الأورام في مراحل لاحقة والتي، على الرغم من العديد من خيارات العلاج، والتشخيص محدودة. 2 ، 3 ، 4 ، 5
وتستند معظم نماذج الماوس الحالية من كرك على زرع الخلايا السرطانية المستمدة من خطوط الخلايا أو أورام المريض في الفئران عوز المناعة. 6 ، 7 ، 8 هذا يؤدي إلى المحلية، واعتمادا على موقع الحقن والخلايا السرطانية المستخدمة للحقن، وأورام النقيلي في بعض الأحيان. 9 ، 10 ومع ذلك، فإن نماذج طعم أجنبي الناتجة لها ماجوr. يجب أن تنشأ في الفئران عوز المناعة، وبالتالي القضاء على التفاعل المعقد بين الورم والجهاز المناعي المضيف. وبالإضافة إلى ذلك، كما هو مشتق الورم سدى من الخلايا المضيفة، والتفاعل بين حمة الورم البشري وسدى الفئران هو عيب، وبالتالي لا تمثل المرض. هذه العيوب يمكن تجنبها من خلال استخدام خطوط الخلايا الفئران للحقن. ومع ذلك، تتوفر سوى عدد قليل من خطوط الخلايا كرك الفئران، ومثل معظم خطوط الخلايا البشرية كرك المتاحة، هي أحادية النسيلة ونابلية للغاية. 11 وباختصار، فإن معظم النماذج المتاحة حاليا الماوس كرك هي اصطناعية للغاية وليس ممثلا تماما للمرض البشري.
نماذج الفئران المهندسة وراثيا (جيمس) من كرك يمكن تجنب هذه العيوب لأنها تتميز أورام الماوس الحقيقية التي يتم إنشاؤها عن طريق تحريض الطفرات الرئيسية من كرك في القولون. 12 ، 13 ،14 ويمكن تحقيق ذلك عن طريق تفعيل الطفرات الجرثومية المشروطة (فلوكسد) من قبل ريكومبيناس كري داخل الغشاء المخاطي القولون والمستقيم. في حين أن في جيمس العديد من الكيانات الورم الأخرى يتم استخدام التعبير جرماني (محرض) كري مدفوعة من قبل المروجين الأنسجة محددة، لا يمكن استخدام جرثومة جرثومية كري في القولون لأن هذا يؤدي إلى عدد كبير من الأورام في جميع أنحاء القولون مما تسبب في وفاة حمولة ورم حميد في في سن مبكرة جدا. لذلك، في النموذج الموصوف هنا يستخدم ناقلات الغدة الفرقية التعبير عن كري لتصيب مقطع القولون القصير. وهذا يؤدي إلى تحريض الأورام داخل هذا الجزء من الغشاء المخاطي في نقطة زمنية يحددها المحقق، مما أدى إلى أورام في نهاية المطاف تتقدم إلى سرطان الغازية والنقالي. الأورام هي أورام الفأر الحقيقية، وتنمو في المكروية سليمة، وبالتالي فهي قادرة على محاكاة كامل من أونكوجينيسيس القولون والمستقيم بما في ذلك التفاعل ورم المضيف والتسلسل النقيلي. هذا النموذج هووبالتالي منصة جذابة لدراسة بيولوجيا السرطان والتجارب العلاجية قبل السريرية.
العيب الرئيسي لنماذج الفئران المهندسة وراثيا لاتفاقية حقوق الطفل هو تعقيدها التقني. التسليم المحلي كري باستخدام المستقيم الشرج الغدة الشرجية في الحقن الشرجية في الفئران التي تحمل الأليلات أبك فلوكسد وصفت من قبل؛ ومع ذلك، فإن حدوث وتعدد وموقع الأورام المعوية يمكن أن يكون متغير للغاية مع هذه التقنية. 15 لذلك، تم تطوير تقنية الحد من العدوى الغدة كري عن طريق لقط الجراحي للجزء التي سيتم تحريضها. 13 لقد قمنا بتعديل هذا الإجراء من أجل تحسين رفاه الحيوان، فضلا عن خفض معدل الوفيات وعدد الأورام الناتجة. مع هذا البروتوكول، يجب أن تكون جميع المختبرات مع خبرة في جراحة القوارض الصغيرة قادرة على إنتاج نموذج وإنتاج الأورام التي هي استنساخه للغاية ويمكن الوصول إليها بسهولة لتنظير القولون. اعتمادا على م الشرطيأوتواتيونس المستخدمة ل أورام، يمكن ملاحظة كامل الطيف من الورم الحميد، سرطان الغازية والانبثاث. كما تقع الأورام في القولون البعيدة، والتقييم بالمنظار التسلسلي هو ممكن بسهولة في هذا النموذج.
في حين أنها سهلة عموما لتوليد والحفاظ على، الكلاسيكية نماذج الماوس كرك على أساس حقن خط الخلية هي اصطناعية وغير قادرة على تلخيص تماما المرض البشري. ونتيجة لذلك، وضعت جيمس. كان أول جيم جيم الماوس أبك مين ، الذي يؤوي طفرة خالية متخالف في الجين أبك، وبالتالي محاكاة …
The authors have nothing to disclose.
ويكرس هذا العمل لذكرى البروفسور موريتز كوخ.
Reagents / consumables | |||
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
Trypsin-EDTA (0.25%, Phenol-Red) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
Normal saline 0.9% (E154) | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
Aqua ad injectabilia | B. Braun Melsungen AG | 235144 | |
Ad5CMV-Cre (adenovirus, c = 2E+11 PFU/mL) | Gene Transfer Vector Core University of Iowa |
||
15 mL, 50 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
Eppendorf tubes 1.5 mL/ 2 mL | Sarstedt AG & Co. | 72,695,400 | |
Petri dish PS 100/15 mm (sterile, Nuclon) | Fisher Scientific GmbH | 10508921/ NUNC150350 | |
1 mL Syringe (without dead volume) – Injekt-F SOLO | Braun/neoLab | 194291661 | |
30G injection needle | BECTON DICKINSON | 304000 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Analgesia / anesthesia | |||
Sevoflurane (Sevoflurane AbbVie) | AbbVie Germany GmbH & Co. KG | – | |
Medical oxygen | Air Liquide Medical GmbH | – | |
Buprenorphine (Temgesic) | Indivior Eu Ltd. | – | |
Bepanthen – ophthalmic ointment | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
Table Top Research Anesthesia Machine x/O2 Flush w/ Sevoflurane Vaporizer | Parkland Scientific | V3000PS/PK | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Surgical Equipment | |||
Cellulose swabs | Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | |
Insulin syringe EMG 1 mL (with 30G cannula) | B. Braun Melsungen AG | 9161627S | |
Fine Bore Tubing (bore: 0.28 mm/ diameter: 0.61mm) | Smiths Medical Deutschland | 800/100/100 | |
Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | |
Iris Scissor – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-11 | |
Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | 12002-12 | |
AutoClip Kit | Fine Science Tools | 12020-00 | |
PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
Curved Micro Serrefine Vascular Clamp | Fine Science Tools | 18055-05 | |
Fogarty Spring Clips | Edwards | CDSAFE 6 | |
Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
Isis – Hair shaver | Aesculap – Braun | – | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Colonoscopy | |||
Cold Light Fountain XENON 175 SCB | Karl Storz | 20132101-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
Fiber Optic Light Cable | Karl Storz | 69495NL | Karl Storz Coloview System Mainz |
TRICAM Three-Chip Camera Head | Karl Storz | 20221030 | Karl Storz Coloview System Mainz |
TRICAM SLII Camera Control Unit | Karl Storz | 20223011-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
15" Flat Screen Monitor EndoVue | Karl Storz | 9415NN | Karl Storz Coloview System Mainz |
HOPKINS Straight Forward Telescope diameter 1.9 mm; length 10 cm autoclavable fiber optic light transmission incorporated |
Karl Storz | 64301AA | |
Protection and Examination Sheath | Karl Storz | 61029C |