Ein genetisch manipuliertes Mausmodell des sporadischen Darmkrebses
Summary
Ein Protokoll für die Etablierung eines gentechnisch veränderten Mausmodells von Darmkrebs durch segmentale Adeno-Cre-Infektion und deren Überwachung durch hochauflösende Koloskopie wird vorgestellt.
Abstract
Trotz der Vorteile der einfachen Anwendbarkeit und der Kostenwirksamkeit haben Darmkrebs-Mausmodelle, die auf der Tumorzellinjektion basieren, schwere Einschränkungen und simulieren die Tumorbiologie und die Tumorzellverbreitung nicht genau. Genetisch manipulierte Mausmodelle wurden eingeführt, um diese Einschränkungen zu überwinden; Allerdings sind solche Modelle technisch anspruchsvoll, vor allem in großen Orgeln wie dem Doppelpunkt, in dem nur ein einziger Tumor gewünscht wird.
Als Ergebnis wurde ein immunkompetentes, genetisch manipuliertes Mausmodell von Darmkrebs entwickelt, das hochgradig einheitliche Tumore entwickelt und sowohl für Tumorbiologie als auch therapeutische Studien eingesetzt werden kann. Die Tumorentwicklung wird durch chirurgische, segmentale Infektion des distalen Dickdarms mit Adeno-Cre-Virus in zusammengesetzten mutomenten Mäusen initiiert. Die Tumoren können leicht durch Koloskopie erkannt und überwacht werden. Wir beschreiben hier die chirurgische Technik der segmentalen Adeno-Infektion vonDer Dickdarm, die Überwachung des Tumors durch hochauflösende Koloskopie und präsentieren die daraus resultierenden kolorektalen Tumoren.
Introduction
Darmkrebs (CRC) ist nach wie vor eine der führenden Ursachen für krebsbedingten Tod in den westlichen Ländern. 1 Während die Prognose von Patienten mit Frühphasenkrankheit gut ist, werden in späteren Stadien viele Tumore diagnostiziert, bei denen trotz zahlreicher Behandlungsmöglichkeiten die Prognose begrenzt ist. 2 , 3 , 4 , 5
Die Mehrheit der aktuellen Mausmodelle von CRC basiert auf der Implantation von aus Zelllinien oder Patiententumoren gewonnenen Tumorzellen in immundefiziente Mäuse. 6 , 7 , 8 Dies führt zu lokalem und je nach Injektionsstelle und den zur Injektion verwendeten Tumorzellen, manchmal metastatischen Tumoren. 9 , 10 Allerdings haben die resultierenden Xenotransplantatmodelle majoR Einschränkungen. Sie müssen in immundefizienten Mäusen etabliert werden, wodurch die komplexe Wechselwirkung zwischen dem Tumor und dem Wirtsimmunsystem eliminiert wird. Zusätzlich, da das Tumorstroma aus Wirtszellen gewonnen wird, ist die Wechselwirkung zwischen menschlichem Tumorparenchym und murinem Stroma defekt und daher nicht repräsentativ für die Erkrankung. Diese Mängel können durch die Verwendung von murinen Zelllinien zur Injektion vermieden werden. Allerdings sind nur wenige murine CRC-Zelllinien verfügbar und sind, ähnlich den meisten verfügbaren menschlichen CRC-Zelllinien, monoklonal und hoch anaplastisch. 11 Zusammenfassend sind die meisten derzeit verfügbaren CRC-Mausmodelle sehr künstlich und nicht vollständig repräsentativ für die menschliche Krankheit.
Genetisch manipulierte Mausmodelle (GEMMs) von CRC können diese Nachteile vermeiden, da sie echte Maus-Tumoren aufweisen, die durch Induktion von Schlüsselmutationen von CRC im Dickdarm entstehen. 12 , 13 ,14 Dies kann durch die Aktivierung von bedingten (floxed) Keimbahnmutationen durch Cre-Rekombinase innerhalb der kolorektalen Schleimhaut erreicht werden. Während in GEMMs von vielen anderen Tumorentitäten Keimbahn (induzierbar) Cre-Expression, die von gewebespezifischen Promotoren angetrieben wird, verwendet wird, kann Keimbahn nicht im Dickdarm verwendet werden, da dies zu einer großen Anzahl von Adenomen im gesamten Dickdarm führt, was den Tod durch gutartige Tumorbelastung verursacht Ein sehr junges Alter. Daher wird in dem hier beschriebenen Modell ein adenoviraler Vektor, der cre ausdrückt, verwendet, um ein kurzes Dickdarmsegment zu infizieren. Dies führt zur Induktion der Tumorentstehung innerhalb dieses Segments der Schleimhaut zu einem von dem Forscher definierten Zeitpunkt, was dazu führt, dass Adenome letztlich zu invasivem und metastasiertem Karzinom fortschreiten. Die Tumoren sind echte Mäusentumore, wachsen in einer intakten Mikroumgebung und sind daher in der Lage, die Gesamtheit der kolorektalen Onkogenese einschließlich der Tumor-Wirt-Interaktion und der metastatischen Kaskade zu simulieren. Dieses Modell istDaher eine attraktive Plattform für Studien der Krebsbiologie und präklinische therapeutische Studien.
Ein wesentlicher Nachteil von gentechnisch veränderten Mausmodellen von CRC ist ihre technische Komplexität. Lokale Cre-Lieferung mit rektalen Adeno-Cre-Enemen bei Mäusen, die flockige Apc-Allele tragen, wurde zuvor beschrieben; Allerdings können die Inzidenz, die Vielfalt und die Lage der Darmtumoren mit dieser Technik sehr variabel sein. 15 Daher wurde die Technik der Begrenzung der Adeno-Cre-Infektion durch chirurgische Klemmung des zu induzierenden Segments entwickelt. 13 Wir haben dieses Verfahren geändert, um den Tierschutz zu verbessern und die Sterblichkeit und die Anzahl der daraus resultierenden Tumore zu reduzieren. Mit diesem Protokoll sollten alle Labore mit Erfahrung in der kleinen Nagetierchirurgie in der Lage sein, das Modell zu reproduzieren und Tumore zu produzieren, die hochgradig reproduzierbar und leicht zugänglich für die Koloskopie sind. Je nach bedingtem mUtationen, die für die Tumorentstehung verwendet werden, können das gesamte Spektrum des Adenoms, des invasiven Karzinoms und der Metastasen beobachtet werden. Da sich die Tumoren im distalen Dickdarm befinden, ist eine serielle endoskopische Beurteilung in diesem Modell leicht möglich.
Protocol
Representative Results
Discussion
Während sie im Allgemeinen leicht zu erzeugen und zu pflegen sind, sind klassische CRC-Mausmodelle, die auf Zelllinieninjektion basieren, künstlich und können die menschliche Krankheit nicht vollständig rekapitulieren. Infolgedessen wurden GEMMs entwickelt. Die erste CRC-GEMM war die Apc Min- Maus, die eine heterozygote Nullmutation im Apc-Gen beherbergt und damit die menschliche Erbkrankheit familiäre adenomatöse Polyposis (FAP) nachahmt. 21 Apc Min Mäuse entwickeln …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit widmet sich der Erinnerung an Professor Moritz Koch.
Materials
| Reagents / consumables | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%, Phenol-Red) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
| Normal saline 0.9% (E154) | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
| Aqua ad injectabilia | B. Braun Melsungen AG | 235144 | |
| Ad5CMV-Cre (adenovirus, c = 2E+11 PFU/mL) | Gene Transfer Vector Core University of Iowa |
||
| 15 mL, 50 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
| Eppendorf tubes 1.5 mL/ 2 mL | Sarstedt AG & Co. | 72,695,400 | |
| Petri dish PS 100/15 mm (sterile, Nuclon) | Fisher Scientific GmbH | 10508921/ NUNC150350 | |
| 1 mL Syringe (without dead volume) – Injekt-F SOLO | Braun/neoLab | 194291661 | |
| 30G injection needle | BECTON DICKINSON | 304000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analgesia / anesthesia | |||
| Sevoflurane (Sevoflurane AbbVie) | AbbVie Germany GmbH & Co. KG | – | |
| Medical oxygen | Air Liquide Medical GmbH | – | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Indivior Eu Ltd. | – | |
| Bepanthen – ophthalmic ointment | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
| Table Top Research Anesthesia Machine x/O2 Flush w/ Sevoflurane Vaporizer | Parkland Scientific | V3000PS/PK | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Cellulose swabs | Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | |
| Insulin syringe EMG 1 mL (with 30G cannula) | B. Braun Melsungen AG | 9161627S | |
| Fine Bore Tubing (bore: 0.28 mm/ diameter: 0.61mm) | Smiths Medical Deutschland | 800/100/100 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Iris Scissor – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| AutoClip Kit | Fine Science Tools | 12020-00 | |
| PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
| Curved Micro Serrefine Vascular Clamp | Fine Science Tools | 18055-05 | |
| Fogarty Spring Clips | Edwards | CDSAFE 6 | |
| Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
| Isis – Hair shaver | Aesculap – Braun | – | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colonoscopy | |||
| Cold Light Fountain XENON 175 SCB | Karl Storz | 20132101-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| Fiber Optic Light Cable | Karl Storz | 69495NL | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM Three-Chip Camera Head | Karl Storz | 20221030 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM SLII Camera Control Unit | Karl Storz | 20223011-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| 15" Flat Screen Monitor EndoVue | Karl Storz | 9415NN | Karl Storz Coloview System Mainz |
| HOPKINS Straight Forward Telescope diameter 1.9 mm; length 10 cm autoclavable fiber optic light transmission incorporated |
Karl Storz | 64301AA | |
| Protection and Examination Sheath | Karl Storz | 61029C |
References
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