Представлен протокол создания генно-инженерной мышиной модели колоректального рака с помощью сегментарной адено-кремовой инфекции и ее наблюдения с помощью колоноскопии высокого разрешения.
Несмотря на преимущества легкой применимости и экономической эффективности, мышиные модели колоректального рака, основанные на инъекции опухолевых клеток, имеют серьезные ограничения и не точно имитируют биологию опухоли и распространение опухолевых клеток. Для преодоления этих ограничений были введены генно-инженерные мышиные модели; Однако такие модели технически требуются, особенно в больших органах, таких как толстая кишка, в которой желательна только одна опухоль.
В результате была разработана иммунокомпетентная генетически модифицированная мышечная модель колоректального рака, которая развивает сильно однородные опухоли и может быть использована для исследований опухолевой биологии, а также для терапевтических испытаний. Развитие опухоли инициируется хирургической, сегментарной инфекцией дистальной кишки с адено-кре-вирусом у сложных условно мутантных мышей. Опухоли можно легко обнаружить и контролировать с помощью колоноскопии. Мы здесь описываем хирургическую методику сегментарной аденоскопной инфекцииОбодочную кишку, наблюдение за опухолью с помощью колоноскопии высокого разрешения и представление полученных колоректальных опухолей.
Колоректальный рак (CRC) по-прежнему является одной из ведущих причин смертности от рака в западных странах. 1 Хотя прогноз пациентов с ранней стадией заболевания хорош, многие опухоли диагностируются на более поздних стадиях, в которых, несмотря на многочисленные варианты лечения, прогноз ограничен. 2 , 3 , 4 , 5
Большинство современных моделей мыши CRC основаны на имплантации опухолевых клеток, полученных из клеточных линий или опухолей пациентов, на иммунодефицитных мышей. 6 , 7 , 8 Это приводит к локальному и, в зависимости от места инъекции и опухолевым клеткам, используемым для инъекций, иногда метастатическим опухолям. 9 , 10 Однако полученные модели ксенотрансплантатов имеют майоR ограничений. Они должны быть установлены у иммунодефицитных мышей, что устраняет сложное взаимодействие между опухолью и иммунной системой хозяина. Кроме того, поскольку строма опухоли получена из клеток-хозяев, взаимодействие между паренхимой опухоли человека и стромой мыши является дефектной и поэтому не является репрезентативным для данного заболевания. Эти недостатки можно избежать с помощью мышиных клеточных линий для инъекций. Однако доступны только несколько линий клеток CRC мыши и, подобно большинству доступных человеческих CRC-клеточных линий, являются моноклональными и сильно анапластичными. 11 Таким образом, большинство доступных в настоящее время моделей мышей CRC являются очень искусственными и не полностью репрезентативными для болезни человека.
Генетически спроектированные мышиные модели (GEMM) CRC могут избежать этих недостатков, поскольку они показывают истинные мышечные опухоли, которые создаются посредством индукции ключевых мутаций CRC в толстой кишке. 12 , 13 ,14 Это может быть достигнуто путем активации условных (floxed) мутаций зародышевой линии путем рекомбиназы в слизистой оболочке колоректального отдела. В то время как в GEMMs многих других опухолевых сущностей используется зародышевая (индуцибельная) экспрессия cre, обусловленная тканеспецифическими промоторами, зародышевая структура не может использоваться в толстой кишке, так как это приводит к большому количеству аденом во всей толстой кишке, вызывающему смерть при доброкачественной опухолевой нагрузке при Очень молодой возраст. Поэтому в описанной здесь модели используется аденовирусный вектор, выражающий cre, для заражения короткого сегмента толстой кишки. Это приводит к индукции опухолевого генеза в этом сегменте слизистой оболочки в момент времени, определенный исследователем, в результате чего аденомы в конечном итоге прогрессируют до инвазивной и метастатической карциномы. Опухоли являются настоящими мышечными опухолями, растут в интактном микроокружении и поэтому способны имитировать полноту колоректального онкогенеза, включая взаимодействие опухоли-хозяина и метастатический каскад. Эта модельПоэтому является привлекательной платформой для исследований биологии рака и доклинических терапевтических испытаний.
Основным недостатком генно-инженерных моделей мыши CRC является их техническая сложность. Ранее была описана локальная сборка с использованием ректальных аденоцитарных клизмов у мышей, несущих аллергические аллели Apx. Однако, частота, множественность и расположение опухолей кишечника могут быть весьма переменными с помощью этой техники. Таким образом, была разработана методика ограничения адено-крестовой инфекции хирургическим зажимом сегмента, который должен быть индуцирован. 13 Мы изменили эту процедуру, чтобы улучшить благосостояние животных, а также снизить смертность и число возникающих опухолей. С помощью этого протокола все лаборатории, обладающие опытом в малой хирургии грызунов, должны иметь возможность воспроизводить модель и производить опухоли, которые очень воспроизводимы и легко доступны для колоноскопии. В зависимости от условного mUtations, используемых для опухолегенеза, можно наблюдать полный спектр аденомы, инвазивной карциномы и метастазов. Поскольку опухоли расположены в дистальной кишке, серийная эндоскопическая оценка легко возможна в этой модели.
Хотя их, как правило, легко создавать и поддерживать, классические мышиные модели CRC, основанные на инъекции клеточной линии, являются искусственными и не в состоянии полностью повторить человеческую болезнь. Как следствие, были разработаны GEMM. Первым CRC GEMM была мышь Apc Min , которая …
The authors have nothing to disclose.
Эта работа посвящена памяти профессора Морица Коха.
Reagents / consumables | |||
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
Trypsin-EDTA (0.25%, Phenol-Red) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
Normal saline 0.9% (E154) | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
Aqua ad injectabilia | B. Braun Melsungen AG | 235144 | |
Ad5CMV-Cre (adenovirus, c = 2E+11 PFU/mL) | Gene Transfer Vector Core University of Iowa |
||
15 mL, 50 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
Eppendorf tubes 1.5 mL/ 2 mL | Sarstedt AG & Co. | 72,695,400 | |
Petri dish PS 100/15 mm (sterile, Nuclon) | Fisher Scientific GmbH | 10508921/ NUNC150350 | |
1 mL Syringe (without dead volume) – Injekt-F SOLO | Braun/neoLab | 194291661 | |
30G injection needle | BECTON DICKINSON | 304000 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Analgesia / anesthesia | |||
Sevoflurane (Sevoflurane AbbVie) | AbbVie Germany GmbH & Co. KG | – | |
Medical oxygen | Air Liquide Medical GmbH | – | |
Buprenorphine (Temgesic) | Indivior Eu Ltd. | – | |
Bepanthen – ophthalmic ointment | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
Table Top Research Anesthesia Machine x/O2 Flush w/ Sevoflurane Vaporizer | Parkland Scientific | V3000PS/PK | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Surgical Equipment | |||
Cellulose swabs | Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | |
Insulin syringe EMG 1 mL (with 30G cannula) | B. Braun Melsungen AG | 9161627S | |
Fine Bore Tubing (bore: 0.28 mm/ diameter: 0.61mm) | Smiths Medical Deutschland | 800/100/100 | |
Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | |
Iris Scissor – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-11 | |
Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | 12002-12 | |
AutoClip Kit | Fine Science Tools | 12020-00 | |
PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
Curved Micro Serrefine Vascular Clamp | Fine Science Tools | 18055-05 | |
Fogarty Spring Clips | Edwards | CDSAFE 6 | |
Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
Isis – Hair shaver | Aesculap – Braun | – | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Colonoscopy | |||
Cold Light Fountain XENON 175 SCB | Karl Storz | 20132101-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
Fiber Optic Light Cable | Karl Storz | 69495NL | Karl Storz Coloview System Mainz |
TRICAM Three-Chip Camera Head | Karl Storz | 20221030 | Karl Storz Coloview System Mainz |
TRICAM SLII Camera Control Unit | Karl Storz | 20223011-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
15" Flat Screen Monitor EndoVue | Karl Storz | 9415NN | Karl Storz Coloview System Mainz |
HOPKINS Straight Forward Telescope diameter 1.9 mm; length 10 cm autoclavable fiber optic light transmission incorporated |
Karl Storz | 64301AA | |
Protection and Examination Sheath | Karl Storz | 61029C |