Kök hücre popülasyonlarının biyolojik örneklerden karakterize edilmesine ve izole edilmesine izin veren yöntemler, kanser ve ötesinde kök hücre hedefli tedavilerin ilerletilmesi için kritik önem taşır. Burada, boya tetiklemeli yan popülasyon fenotipini kullanarak kanser kök hücre izolasyonu için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.
Kanser, kök hücre kaynaklı bir hastalıktır ve bu hücrelerin ortadan kaldırılması önemli bir terapötik hedeftir. Kanser Kök Hücrelerinin (CSC) zayıf yönlerinin çözülmesi ve uygun moleküler hedeflerin belirlenmesi, hücre çizgileri ve ex vivo tümör dokusu gibi heterojen örneklerde spesifik ayrımcılığa izin veren yöntemlere dayanmaktadır. Akış sitometrisi / FACS, tek hücreli seviyede biyolojik numuneleri çok parametrik olarak incelemek için güçlü bir teknolojidir ve aşağı akım analizleri için canlı hücrelerin geri kazanılması için seçilen yöntemdir. CD44 ve CD133 gibi yüzey markörlerinin yanı sıra aldehit dehidrogenaz enzimatik aktivitesinin saptanması, FACS tarafından tümör numunelerinden CSC'lerin tanımlanması ve sınıflandırılması için sıklıkla kullanılmaktadır. Metodolojik detaylarda burada açıklanan tamamlayıcı bir yaklaşım, genellikle yan popülasyon (SP) olarak adlandırılan farklı floresan-dim hücrelerinin bir popülasyonunu tanımlayan ABC ilaç taşıyıcıları ile fonksiyonel boya ekstrüzyonunu kullanmaktadır. SPKanser hücreleri kanonik kök hücre özellikleri sergiler ve boya ekstrüzyon ilaç taşıyıcısını (en sık ABCBl / P-glikoprotein / MDR1 / CD243 ve ABCG2 / Bcrp1 / CD338) inhibe eden ajanlar kullanılarak yok edilebilir ve işlevsel olarak teyit edilebilir. Üstelik SP testi, yüzey antijenlerinin boyanması, aldehid dehidrogenaz tespiti ve ölü hücre ayrımcılığı ( örneğin , 7-AAD veya propidyum iyodür (PI)) gibi diğer akış sitometrik değerlendirmeleriyle uyumludur. Bu nedenle, mekanik olarak fenotipik bir parametreden ziyade işlevsel olan CSC tanımlama, izolasyon ve alt karakterizasyon için değerli ve geniş bir şekilde uygulanabilir bir yöntem tanımlıyoruz. Başlangıçta tetikleyici boya olarak Hoechst 33342 ile yapılmış olsa da, burada, mor renkli bir lazer kaynağı ile donatılmış herhangi bir akış sitometresinde çözülebilen daha yeni olan Violet boya dayalı SP fenotipine odaklanırız.
Primer kanser terapilerinin etkinliği, hastalığın genetik ve moleküler anlayışındaki gelişen ilerlemeler ve terapötik antikorlar ve küçük molekül inhibitörleri gibi hedefli ilaçların ortaya çıkması nedeniyle son on yılda önemli ölçüde iyileşmiştir. Aksine, metastatik ve tekrarlayan hastalık halen tedavi edilemez durumdadır ve morbidite ve mortalite bu klinik ortamlarda yüksek kalmaya devam etmektedir. CSC'ler tümörler içinde ayrı bir alt popülasyonu temsil eder ve klonojenisite / tümöre özdeşlik, çoklu ilaç direnci ve asimetrik hücre bölünmesi 1 , 2 gibi kanonik kök hücre özellikleri ile donatılırlar. Böylelikle, KKSler metastatik ilerlemeyi ve tümör heterojenliğini yönlendirmekle kalmaz aynı zamanda hastayı nüksetmeye yatkınlaştırmak için tedavi sırasında da devam eder. Terapötik CSC eliminasyonu, hastalık tekrarını önlemek ve kanserin uzun süreli iyileşmesine izin vermek için önemli tıbbi bir ihtiyaçtır 3 </sup>.
Koruma açığının tanımlanması ve CSC'lerin ortadan kaldırılması için stratejilerin aydınlatılması, sonraki ekspresyon profillemesi ve / veya fonksiyonel inceleme için biyolojik numunelerden arındırılmalarına izin veren yöntemlere bağlıdır. Bunun gibi yöntemler, bu hücrelere özgü yüzey, hücre içi veya işlevsel belirteçlere dayanır. CSC'ye spesifik yüzey işaretleyiciler arasında CD44, CD133, CD24 ve CD90 bulunur ve bunlarla sınırlı olmamak üzere meme kanseri ve kolon kanseri de dahil olmak üzere çeşitli tümör varlıklarındaki CSC popülasyonlarını tanımlamak için kullanılırlar. Bir başka markör olan aldehit dehidrogenaz (ALDH), hücre içi lokalizasyonu gösterir ve enzimatik dönüşümü ışık üreten ilgili bir substrat sağlayarak fonksiyonel olarak tespit edilebilir. Bu testi kullanarak CSC popülasyonları çeşitli tümör varlıklarında da tespit edilmiştir 5 . Tamamlayıcı bir yöntem, genelde SP analizi olarak anılır ve burada m olarak tasvir edilir. Etodolojik detay, 6 , 7 , 8 floresan-loş gövde benzeri hücrelerin küçük popülasyonlarını tanımlamak için ABC ilaç taşıyıcıları tarafından aktif boya akışı kullanmaktadır. Bunu sağlamak için belirli bir numune, pasif difüzyon yoluyla tüm hücrelere giren ve bağlanma için nükleer ve mitokondriyal DNA'yı hedefleyen bir lipofilik DNA bağlama floroforunun mevcudiyetinde inkübe edilir. ABC ilâç taşıyıcısı ifadesi bulunmayan CSC'ler boya biriktirerek parlak floresans oluştururken, CSC aktif olarak flüoresansı düşüren boyayı sıkıştırır. İlaç taşıyıcı aktivitesinin farmakolojik olarak inhibisyonu, SP fenotipini ortadan kaldırır ve işlevsel olarak teyit eder ve kontrol amaçlı kullanılmalıdır. SP özelliklerini sergileyen CSC popülasyonları diğerlerinin yanı sıra yumurtalık kanseri 9 , 10 , prostat kanseri 11 ,> 12, meme kanseri 13 , akciğer kanseri 14 , endometriyal kanser 15 , gliom 16 , 17 ve kemik sarkomu 18 . Önemli bir şekilde, spesifik bir tümör hücresi ayrımcılık stratejisi (bazı konakçı hücre popülasyonları da SP özellikleri sergileyebilir) gibi birincil materyal ilave zorluklar ortaya koymasına rağmen, SP testi hem kanser hücre hatları hem de primer tümör dokusu ile uyumludur .
En çok bilinen iki SP taşıyıcı ilaç taşıyıcısı ABCBl / P-glikoprotein / MDRl / CD243 ve ABCG2 / Bcrpl / CD338 8,9,21; Bununla birlikte, diğer ilaç taşıyıcıları SP fenotipinin de bir moleküler belirleyicisi olabilir ( örn. , ABCB5) 22 . ABCB1Verapamil ile etkin bir şekilde bloke edilebilirken, ABCG2'nin aktivitesi fumitremorgin C (FTC) 6 , 19 ile özel olarak kaldırılabilir. SP analizinin belirli bir gücü, diğer lekelenmelerle ( örneğin , yüzey markörleri ve ALDH) birlikte kullanılabilmesi ve canlı hücre geri kazanımının, bu nedenle aşağı akışlı fonksiyonel araştırmalarla uyumlu olmasını sağlamasıdır. Dahası, SP algılama CSC popülasyonları 9 , 23 arasında ABC ilaç taşıyıcılarının yüksek korunması nedeniyle genel olarak uygulanabilir.
Başlangıçta, SP algılama, tetikleyici bir boya 24 olarak Hoechst 33342 kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu boya mükemmel bir çözünürlük sağlar, ancak ultraviyole lazer uyarımını gerektirir; Dolayısıyla uygulanabilirliği doğal olarak ileri teknoloji akış sitometri aletleri ile sınırlıdır. DyeCycle Violet (DCV) 25'in ortaya çıkışı yeni avenu açtı.Sp analizleri için geliştirilmiş ve ultraviyole lazer kaynağı olmayan standart akış sitometrik enstrümanlarına (DCV-SP hücrelerini çözmek için mor bir lazer kaynağı yeterlidir) uygulanabilirliğini genişletmiştir. Önemlisi, Hoechst 33342 ve DCV, ortak pompa özgüllüklerini paylaşır, bu da boyanın aynı hücre popülasyonlarını tanımlaması gerektiğini gösterir.
Burada, bağımsız laboratuvarlarda hızlı ve kolay üreme için DCV'ye dayalı SP analizinin ayrıntılı bir deneysel protokolünü sunuyoruz. Yazıyı, bu yararlı hücre biyolojik yönteminin optimizasyonuna ve standardizasyonuna katkıda bulunması gereken CSC araştırmacıları için bir kaynak olarak algılıyoruz.
Kanserin klinik yönetimindeki ilerleme, CSC'leri hedef alan tedavi yöntemlerinin gelişimine bağlıdır. CSC'lerin biyolojik numunelerden güvenilir şekilde izole edilmesine izin veren yöntemler, uygun hedeflerin belirlenmesini hızlandıracak ve bu nedenle bu çabanın kritik önemi altındadır. SP analizi, ABC ilaç taşıyıcılarını ifade eden CSC popülasyonlarını tanımlamak için kurulmuş ve değerli bir tekniktir ve DCV'nin uygulanması, standart akış sitometrik araçlarına uygulanabili…
The authors have nothing to disclose.
Maximilian Boesch, Avusturya Bilim Fonu FWF (hibe numarası J-3807) bir Erwin Schrödinger Kardeşliği tarafından desteklenmektedir.
Vybrant DyeCycle Violet | Thermo Fisher Scientific | V35003 | Ready to use |
Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | Dissolve in ethanol |
Fumitremorgin C | Sigma-Aldrich | F9054 | Dissolve in DMSO |
7-AAD (or propidium iodide) | BioLegend | 420403 | Ready to use |
Standard cell culture reagents (e.g., medium, FBS, L-glutamine, antibiotics, PBS, trypsin-EDTA, etc.) | Different suppliers | ||
Sample/cells of interest (e.g., human or murine cancer cell line, human or murine tumor tissue) | Different suppliers | ||
Flow cytometric instrument (analyzer or cell sorter) | Different suppliers | Violet laser source required | |
FACS tubes (round-bottom) | Different suppliers | Tubes with cap recommended | |
70 µm cut-off strainers | Different suppliers | Optional but recommended | |
Digestion enzyme mix (e.g., collagenase/dispase/Dnase) | Different suppliers | Only relevant for tissue dissociation | |
Flurochrome-conjugated antibodies against surface markers of interest | Different suppliers | Optional | |
ALDEFLUOR Kit | STEMCELL Technologies | 01700 | Optional |