Methoden die de karakterisering en isolatie van stamcellenpopulaties van biologische monsters mogelijk maken, zijn cruciaal voor het voorschot van stamcelgerichte behandelingen in kanker en daarbuiten. Hier geven we een gedetailleerd protocol voor kanker stamcellenisolatie met behulp van het kleurstof geactiveerde zijpopulatie fenotype.
Kanker is een stamcelgedreven ziekte en uitroeiing van deze cellen is een belangrijk therapeutisch doel geworden. Het ontcijferen van kwetsbaarheden van kankerstamcellen (CSC's) en het identificeren van geschikte moleculaire doelen berust op methoden die hun specifieke discriminatie in heterogene monsters toelaten, zoals cellijnen en ex vivo tumorweefsel. Flowcytometrie / FACS is een krachtige technologie om biologische monsters multi-parametrisch op het enkelcelniveau te dissecteren en is tot op heden de methode van keuze om levende cellen te herstellen voor downstream-analyses. Oppervlakte markers zoals CD44 en CD133 evenals detectie van aldehyde dehydrogenase enzymatische activiteit zijn vaak gebruikt om CSC's uit tumormonsters door FACS te definiëren en uit te sorteren. Een complementaire aanpak, die hier in het methodologisch detail wordt uitgebeeld, maakt gebruik van functionele kleurstofextrusie door ABC-geneesmiddeltransporteurs, die een duidelijke populatie van fluorescentiedimpers identificeren die gewoonlijk worden aangeduid als zijpopulatie (SP). SPKankercellen vertonen kanonieke stamcelkenmerken en kunnen worden opgeheven en functioneel bevestigd met behulp van middelen die de kleurstof-extruderende geneesmiddeltransporteur remmen (meestal ABCB1 / P-glycoproteïne / MDR1 / CD243 en ABCG2 / Bcrp1 / CD338). Bovendien is de SP-analyse verenigbaar met andere stromingscytometrische evaluaties zoals het vlek van oppervlakteantigenen, detectie van aldehyde dehydrogenase en discriminatie van de doodcellen ( bijv . Met 7-AAD of propidiumjodide (PI)). Zo beschrijven we een waardevolle en breed toepasselijke methode voor CSC-identificatie, isolatie en subkarakterisering mechanistisch gebaseerd op een functionele, in plaats van een fenotypische parameter. Hoewel oorspronkelijk uitgevoerd met Hoechst 33342 als triggerende kleurstof, concentreren wij ons hier op het meer recente Violet-kleurstof-gebaseerde SP-fenotype dat oplosbaar is op elke stromingscytometer uitgerust met een violette laserbron.
De werkzaamheid van primaire kankertherapieën is in het afgelopen decennium aanzienlijk verbeterd door dwingende vooruitgang in het genetische en moleculaire begrip van de ziekte en de komst van gerichte geneesmiddelen, zoals therapeutische antilichamen en kleine molecuul-remmers. Daarentegen is de metastatische en terugkerende ziekte nog steeds typisch ongeneesbaar, en de morbiditeit en sterfte blijven hoog in deze klinische instellingen. CSC's vertegenwoordigen een onderscheidende subpopulatie binnen tumoren en zijn voorzien van kanonieke stamcel eigenschappen zoals clonogeniciteit / tumorigeniciteit, resistentie tegen meerdere geneesmiddelen en asymmetrische celverdeling 1 , 2 . CSCs drijven dus niet alleen metastatische progressie en tumor heterogeniteit, maar blijven ook tijdens de behandeling de patiënt voorspellen om terug te keren. Therapeutische CSC-eliminatie is daarom een belangrijke medische noodzaak om ziekteherhaling te voorkomen en langdurige genezing van kanker 3 mogelijk te maken </sup>.
Het identificeren van kwetsbaarheden en het ophelderen van strategieën om CSC's zwaar te elimineren hangt af van methoden die hun zuivering van biologische monsters toelaten voor latere expressieprofielen en / of functioneel onderzoek. Op hun beurt zijn dergelijke methoden gebaseerd op oppervlak-, intracellulaire of functionele markers die specifiek zijn voor deze cellen. CSC-specifieke oppervlakte markers omvatten, maar zijn niet beperkt tot, CD44, CD133, CD24 en CD90, en zijn gebruikt om CSC populaties te identificeren in een verscheidenheid aan tumorentiteiten waaronder borstkanker en dikke darmkanker 4 . Een andere marker, aldehyde dehydrogenase (ALDH), toont intracellulaire lokalisatie en kan functioneel gedetecteerd worden, waarbij een respectief substraat wordt verschaft waarvan de enzymatische omzetting licht produceert. Met behulp van deze test zijn CSC-populaties ook in diverse tumorentiteiten geïdentificeerd 5 . Een complementaire methode, vaak aangeduid als SP analyse en hier weergegeven in m Ethodologisch detail, maakt gebruik van actieve kleurstofuitstroming door ABC-geneesmiddeltransporteurs om kleine populaties van fluorescentiedimme stamachtige cellen 6 , 7 , 8 te identificeren. Om dit te bereiken wordt een gegeven monster geïncubeerd in aanwezigheid van een lipofiele DNA-bindende fluorofoor, die alle cellen binnentreedt via passieve diffusie en target nucleair en mitochondriaal DNA voor binding. Niet-CSC's zonder ABC-geneesmiddeltransportuitdrukking accumuleren de kleurstof die resulteert in heldere fluorescentie, terwijl CSC's de kleurstof actief extruderen die de fluorescentie vermindert. Farmacologische remming van geneesmiddeltransportactiviteiten schrapt en functioneert het SP-fenotype functioneel en moet gebruikt worden voor controledoeleinden. CSC populaties die SP kenmerken vertonen zijn onder meer beschreven in eierstokkanker 9 , 10 , prostaatkanker 11 ,> 12, borstkanker 13 , longkanker 14 , endometriumkanker 15 , glioma 16 , 17 en botssarcoom 18 . Belangrijk is dat de SP-analyse verenigbaar is met zowel kankercellijnen als primaire tumorweefsel, hoewel primaire materiaal aanvullende uitdagingen veroorzaakt, zoals de vereiste voor een specifieke tumorcel-discriminatiestrategie (bepaalde gastheercellenpopulaties kunnen ook SP-kenmerken vertonen) 19 , 20 .
De twee meest gevestigde SP-toedienende geneesmiddeltransporteurs zijn ABCB1 / P-glycoproteïne / MDR1 / CD243 en ABCG2 / Bcrp1 / CD338 8 , 9 , 21 ; Andere geneesmiddeltransporteurs kunnen echter ook een moleculaire determinant van het SP-fenotype zijn (bijvoorbeeld ABCB5) 22 . ABCB1Kan efficiënt geblokkeerd worden met verapamil, terwijl de activiteit van ABCG2 specifiek kan worden opgeheven met fumitremorgine C (FTC) 6 , 19 . Een specifieke kracht van SP-analyse is dat het kan worden gecombineerd met andere vlekken ( bijv. Oppervlakmarkers en ALDH) en dat het het mogelijk maakt om de celcellen te herstellen, zodat ze compatibel zijn met downstream functionele onderzoeken. Bovendien is SP detectie breed toepasbaar door het hoge behoud van ABC drugstransporteurs onder CSC populaties 9 , 23 .
Oorspronkelijk is SP detectie uitgevoerd met behulp van Hoechst 33342 als een triggerende kleurstof 24 . Deze kleurstof bereikt een uitstekende resolutie, maar vereist ultraviolette laser excitatie; Vandaar dat de toepasselijkheid daarvan uiteraard beperkt is tot high-end flowcytometrische instrumenten. De komst van DyeCycle Violet (DCV) 25 heeft nieuwe avenu geopendEs voor SP analyse en verlengde de toepasbaarheid van deze methode op standaard flow cytometrische instrumenten die geen ultraviolette laserbron hebben (een violette laserbron is voldoende om DCV-SP cellen op te lossen). Belangrijk is dat Hoechst 33342 en DCV gemeenschappelijke pompspecificiteiten delen, wat aangeeft dat ofwel kleurstof dezelfde celpopulaties moet identificeren.
Hier geven we een gedetailleerd experimenteel protocol van DCV-gebaseerde SP analyse voor snelle en eenvoudige weergave in onafhankelijke labs. Daarom zien we ons artikel als een bron voor CSC-onderzoekers die bijdragen aan de optimalisatie en standaardisatie van deze nuttige celbiologische methode.
De vooruitgang in het klinisch beheer van kanker hangt ook af van de ontwikkeling van behandelingsmodaliteiten die CSC's richten. Methoden die een betrouwbare isolatie van CSC's uit biologische monsters mogelijk maken, zullen de identificatie van geschikte doelen versnellen en zijn daarom van essentieel belang bij deze poging. SP-analyse is een gevestigde en waardevolle techniek om CSC-populaties te identificeren die ABC-drugstransporteurs uitdrukken en de implementatie van DCV heeft haar toepasselijkheid uitgeb…
The authors have nothing to disclose.
Maximilian Boesch wordt ondersteund door een Erwin Schrödinger Fellowship van het Oostenrijkse Wetenschapsfonds FWF (subsidienummer J-3807).
Vybrant DyeCycle Violet | Thermo Fisher Scientific | V35003 | Ready to use |
Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | Dissolve in ethanol |
Fumitremorgin C | Sigma-Aldrich | F9054 | Dissolve in DMSO |
7-AAD (or propidium iodide) | BioLegend | 420403 | Ready to use |
Standard cell culture reagents (e.g., medium, FBS, L-glutamine, antibiotics, PBS, trypsin-EDTA, etc.) | Different suppliers | ||
Sample/cells of interest (e.g., human or murine cancer cell line, human or murine tumor tissue) | Different suppliers | ||
Flow cytometric instrument (analyzer or cell sorter) | Different suppliers | Violet laser source required | |
FACS tubes (round-bottom) | Different suppliers | Tubes with cap recommended | |
70 µm cut-off strainers | Different suppliers | Optional but recommended | |
Digestion enzyme mix (e.g., collagenase/dispase/Dnase) | Different suppliers | Only relevant for tissue dissociation | |
Flurochrome-conjugated antibodies against surface markers of interest | Different suppliers | Optional | |
ALDEFLUOR Kit | STEMCELL Technologies | 01700 | Optional |