רתימת DNA- מופעלות בצד האוכלוסייה פנוטיפ לזהות ולטהר תאי גזע סרטניים מ דוגמאות ביולוגיות
Summary
שיטות המאפשרות אפיון ובידוד של אוכלוסיות תאי גזע מדגימות ביולוגיות הן קריטיות לקידום טיפולים מוכווני תאי גזע בסרטן ומעבר לו. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לבידוד תאי גזע סרטניים באמצעות פנוטיפ האוכלוסייה בצד מופעלות בצד.
Abstract
סרטן הוא מחלה מונעת בתאי גזע וביעור תאים אלה הפך למטרה טיפולית חשובה. פענוח פגיעויות של תאי גזע סרטניים (CSCs) וזיהוי מטרות מולקולריות מתאימות מסתמך על שיטות המאפשרות אפליה ספציפית שלהם דגימות הטרוגניות כגון שורות תאים ו vivo רקמת הגידול. זרימת cytometry / FACS היא טכנולוגיה רבת עוצמה רב פרמטרי לנתח דגימות ביולוגיות ברמת התא בודד הוא עד כה את שיטת הבחירה לשחזר תאים חיים עבור ניתוחים במורד הזרם. סמנים פני השטח כגון CD44 ו CD133, כמו גם זיהוי של פעילות אנזימטית aldehyde dehydrogenase שימשו לעתים קרובות כדי להגדיר ולמיין CSCs מדגימות הגידול על ידי FACS. גישה משלימה, המתוארת כאן בפירוט מתודולוגי, עושה שימוש שחול פונקציונלי לצבוע על ידי מובילי סמים ABC, אשר מזהה אוכלוסייה ברורה של תאים פלואורסצנטי עמום המכונה בדרך כלל האוכלוסייה בצד (SP). SPתאים סרטניים מציגים מאפיינים של תאי גזע קנוניים וניתנים לביטול ואימות פונקציונלי באמצעות סוכנים המעכבים את טרנספורטר התרופה הסוחטת (לרוב ABCB1 / P-glycoprotein / MDR1 / CD243 ו- ABCG2 / Bcrp1 / CD338). יתר על כן, אסאי SP תואם עם הערכות cytometric זרימה אחרים כגון מכתים של אנטיגנים פני השטח, זיהוי dededrogenase aldehyde ואפליה התא המת ( למשל , עם 7-AAD או propidium יודיד (PI)). לכן, אנו מתארים שיטה בעלת ערך ויישום נרחב עבור זיהוי CSC, בידוד ותת אפיון מכני מבוסס על פונקציונלי, ולא פנוטיפי פרמטר. למרות שבוצע במקור עם Hoechst 33342 כמו צבע מפעילה, אנחנו כאן להתמקד האחרונה יותר צבע ויולט צבע מבוססי פנוטיפ כי הוא solutionvable על כל cytometer זרימה מצויד עם מקור לייזר סגול.
Introduction
היעילות של טיפולים ראשוניים בסרטן השתפרה באופן משמעותי במהלך העשור האחרון, בשל ההתקדמות המשכנעת בהבנה הגנטית והמולקולרית של המחלה ובפיתוח תרופות ממוקדות כגון נוגדנים טיפוליים ומעכבי מולקולה קטנים. לעומת זאת, מחלה גרורתית וחוזרת ונשנית עדיין חשוכת מרפא, ותחלואה ותמותה נותרו גבוהות במסגרות קליניות אלו. CSCs מייצגים subpopulation ברורים בתוך גידולים והם ניחן תכונות תא גזע קנוני כגון clonogenicity / tumorigenicity, התנגדות מרובה סמים חלוקת תאים אסימטרי 1 , 2 . לפיכך, CSCs לא רק להניע התקדמות גרורה והטרוגניות הגידול, אלא גם להתמיד במהלך הטיפול כדי מראש את החולה כדי להישנות. טיפול CSC טיפולית היא לפיכך צורך רפואי חשוב כדי למנוע הישנות המחלה ולאפשר תרופה ארוכת טווח של סרטן 3 </suP>.
זיהוי הפגיעויות והבהרת האסטרטגיות לביעור CSCs תלוי במידה רבה בשיטות המאפשרות טיהורן מדגימות ביולוגיות עבור פרופיל הביטוי הבא ו / או חקירה תפקודית. בתורו, שיטות כאלה מסתמכים על פני השטח, תאיים או סמנים פונקציונליים ספציפיים עבור תאים אלה. סמנים פנימיים של CSC כוללים, אך אינם מוגבלים, CD44, CD133, CD24 ו- CD90, והם שימשו לזיהוי אוכלוסיות CSC במגוון גידולים סרטניים, כולל סרטן השד וסרטן המעי הגס. סמן נוסף, אלדהיד dehydrogenase (ALDH), מראה לוקליזציה תאיים וניתן לזהות פונקציונלית לספק מצע בהתאמה אשר המרה אנזימטית מייצרת אור. באמצעות בדיקה זו, אוכלוסיות CSC זוהו גם אצל גידולים מגוונים. שיטה משלימה, המכונה בדרך כלל ניתוח SP ותיארו כאן מ בפירוט דינמי, רתמות פעילה לצבוע על ידי מובילים סמים ABC לזהות אוכלוסיות קטנות של פלואורסצנטי אפל כמו בתאים 6 , 7 , 8 . כדי להשיג זאת, מדגם נתון מודגרת בנוכחות של fluorophore DNA lipophilic מחייב אשר מזין את כל התאים באמצעות דיפוזיה פסיבית מטרות DNA גרעיני ומיטוכונדריאלי מחייב. שאינם CSCs נטול ביטוי ABC סמים transporter לצבור את הצבע וכתוצאה מכך הקרינה בהירים, ואילו CSCs פעיל extrude צבע אשר מפחית הקרינה. עיכוב תרופתי של פעילות טרנספורטר התרופה מבטל ומאשר פונקציונלית SP פנוטיפ SP ויש להשתמש בו לצורך שליטה. אוכלוסיות CSC המציגות מאפייני SP נחשפו, בין היתר, בסרטן השחלות 9 , 10 , סרטן הערמונית 11 ,> 12, סרטן השד 13 , סרטן ריאה 14 , סרטן רירית הרחם 15 , גליומה 16 , 17 ו סרקומה עצם 18 . חשוב לציין, את assay SP תואמת הן שורות תאים סרטניים ורקמת הגידול הראשוני, למרות שהחומר העיקרי מציב אתגרים נוספים כגון הדרישה לאסטרטגיה ספציפית אפליה תא הגידול (אוכלוסיות תאים מסוימים המארח יכול להפגין תכונות SP גם כן) 19 , 20 .
שני הוקמה ביותר SP-conferring סמים מובילים הם ABCB1 / P-glycoprotein / MDR1 / CD243 ו ABCG2 / Bcrp1 / CD338 8 , 9 , 21 ; עם זאת, מובילי סמים אחרים יכולים להיות מקדם מולקולרי של פנוטיפ SP מדי ( למשל , ABCB5) 22 . ABCB1ניתן לחסום ביעילות עם verapamil ואילו הפעילות של ABCG2 ניתן לבטל במיוחד עם fumitremorgin C (FTC) 6 , 19 . כוח מסוים של ניתוח SP הוא כי זה יכול להיות משולב עם כתמים אחרים ( למשל , סמנים פני השטח ALDH) וכי זה מאפשר התא התא התא לחיות ובכך להיות תואם עם החקירות הפונקציונליות במורד הזרם. יתר על כן, זיהוי SP רלוונטי בעיקר בשל שימור גבוה של ABC סמים מובילי בקרב אוכלוסיות CSC 9 , 23 .
במקור, SP זיהוי בוצעה באמצעות Hoechst 33342 כמו צבע מפעילה 24 . צבע זה משיג רזולוציה מעולה אך דורש עירור לייזר אולטרא סגול; ולכן תחולתו מוגבלת באופן טבעי למכשירים cytometric זרימה גבוהה. הופעתו של DyeCycle ויולט (DCV) 25 פתחה avenu חדשEs לניתוח SP והרחיב את תחולתה של שיטה זו למכשירים cytometric זרימה סטנדרטי חסר מקור לייזר אולטרה סגול (מקור לייזר סגול מספיק כדי לפתור תאים DCV-SP). חשוב לציין, Hoechst 33342 ו DCV לשתף ספציפיות משאבה משותפת, המציין כי גם צבע צריך לזהות את אוכלוסיות תאים אותו.
כאן, אנו מספקים פרוטוקול ניסיוני מפורט של DC מבוססי ניתוח SP עבור רבייה מהירה וקלה במעבדות עצמאיות. לכן אנו רואים במאמר שלנו משאב לחוקרי CSC, אשר אמור לתרום לאופטימיזציה ולתקינה של שיטה תאית-ביולוגית שימושית זו.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההתקדמות בניהול הקליני של סרטן תלויה גם בפיתוח של שיטות טיפול המכוונות CSCs. שיטות המאפשר בידוד אמין של CSCs מ דגימות ביולוגיות יאיץ את הזיהוי של מטרות מתאימות ולכן הם בעלי חשיבות קריטית במאמץ זה. ניתוח SP היא טכניקה מבוססת הוקמה כדי לזהות אוכלוסיות CSC המבטאים ABC סוחרי סמי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Maximilian Boesch נתמך על ידי אחוות ארווין Schrödinger של קרן המדע האוסטרי FWF (מענק מספר J-3807).
Materials
| Vybrant DyeCycle Violet | Thermo Fisher Scientific | V35003 | Ready to use |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | Dissolve in ethanol |
| Fumitremorgin C | Sigma-Aldrich | F9054 | Dissolve in DMSO |
| 7-AAD (or propidium iodide) | BioLegend | 420403 | Ready to use |
| Standard cell culture reagents (e.g., medium, FBS, L-glutamine, antibiotics, PBS, trypsin-EDTA, etc.) | Different suppliers | ||
| Sample/cells of interest (e.g., human or murine cancer cell line, human or murine tumor tissue) | Different suppliers | ||
| Flow cytometric instrument (analyzer or cell sorter) | Different suppliers | Violet laser source required | |
| FACS tubes (round-bottom) | Different suppliers | Tubes with cap recommended | |
| 70 µm cut-off strainers | Different suppliers | Optional but recommended | |
| Digestion enzyme mix (e.g., collagenase/dispase/Dnase) | Different suppliers | Only relevant for tissue dissociation | |
| Flurochrome-conjugated antibodies against surface markers of interest | Different suppliers | Optional | |
| ALDEFLUOR Kit | STEMCELL Technologies | 01700 | Optional |
References
- Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Tackling the cancer stem cells – what challenges do they pose?. Nat Rev Drug Discov. 13 (7), 497-512 (2014).
- Boesch, M., et al. Heterogeneity of Cancer Stem Cells: Rationale for Targeting the Stem Cell Niche. Biochim Biophys Acta. 1866 (2), 276-289 (2016).
- Li, Y., et al. Suppression of cancer relapse and metastasis by inhibiting cancer stemness. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (6), 1839-1844 (2015).
- Greve, B., Kelsch, R., Spaniol, K., Eich, H. T., Götte, M. Flow cytometry in cancer stem cell analysis and separation. Cytometry A. 81 (4), 284-293 (2012).
- Marcato, P., Dean, C. A., Giacomantonio, C. A., Lee, P. W. Aldehyde dehydrogenase: its role as a cancer stem cell marker comes down to the specific isoform. Cell Cycle. 10 (9), 1378-1384 (2011).
- Golebiewska, A., Brons, N. H., Bjerkvig, R., Niclou, S. P. Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research. Cell Stem Cell. 8 (2), 136-147 (2011).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nat Med. 7 (9), 1028-1034 (2001).
- Boesch, M., et al. The side population of ovarian cancer cells defines a heterogeneous compartment exhibiting stem cell characteristics. Oncotarget. 5 (16), 7027-7039 (2014).
- Szotek, P. P., et al. Ovarian cancer side population defines cells with stem cell-like characteristics and Mullerian Inhibiting Substance responsiveness. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11154-11159 (2006).
- Brown, M. D., et al. Characterization of benign and malignant prostate epithelial Hoechst 33342 side populations. Prostate. 67 (13), 1384-1396 (2007).
- Mathew, G., et al. ABCG2-mediated DyeCycle Violet efflux defined side population in benign and malignant prostate. Cell Cycle. 8 (7), 1053-1061 (2009).
- Engelmann, K., Shen, H., Finn, O. J. MCF7 side population cells with characteristics of cancer stem/progenitor cells express the tumor antigen MUC1. Cancer Res. 68 (7), 2419-2426 (2008).
- Ho, M. M., Ng, A. V., Lam, S., Hung, J. Y. Side population in human lung cancer cell lines and tumors is enriched with stem-like cancer cells. Cancer Res. 67 (10), 4827-4833 (2007).
- Kato, K., et al. Endometrial cancer side-population cells show prominent migration and have a potential to differentiate into the mesenchymal cell lineage. Am J Pathol. 176 (1), 381-392 (2010).
- Bleau, A. M., et al. PTEN/PI3K/Akt pathway regulates the side population phenotype and ABCG2 activity in glioma tumor stem-like cells. Cell Stem Cell. 4 (3), 226-235 (2009).
- Harris, M. A., et al. Cancer stem cells are enriched in the side population cells in a mouse model of glioma. Cancer Res. 68 (24), 10051-10059 (2008).
- Murase, M., et al. Side population cells have the characteristics of cancer stem-like cells/cancer-initiating cells in bone sarcomas. Br J Cancer. 101 (8), 1425-1432 (2009).
- Boesch, M., Wolf, D., Sopper, S. Optimized Stem Cell Detection Using the DyeCycle-Triggered Side Population Phenotype. Stem Cells Int. 2016, 1652389 (2016).
- Golebiewska, A., et al. Side population in human glioblastoma is non-tumorigenic and characterizes brain endothelial cells. Brain. 136 (PT 5), 1462-1475 (2013).
- Boesch, M., et al. Drug transporter-mediated protection of cancer stem cells from ionophore antibiotics. Stem Cells Transl Med. 4 (9), 1028-1032 (2015).
- Fukunaga-Kalabis, M., et al. Tenascin-C promotes melanoma progression by maintaining the ABCB5-positive side population. Oncogene. 29 (46), 6115-6124 (2010).
- Dean, M., Fojo, T., Bates, S. Tumour stem cells and drug resistance. Nat Rev Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye. Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).
- Boesch, M., et al. High prevalence of side population in human cancer cell lines. Oncoscience. 3 (3-4), 85-87 (2016).
- Ali, M. Y., Anand, S. V., Tangella, K., Ramkumar, D., Saif, T. A. Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry. J Vis Exp. (100), e52532 (2015).
- Azari, H., et al. Isolation and expansion of human glioblastoma multiforme tumor cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. (56), e3633 (2011).
- Hasselbach, L. A., et al. Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry. J Vis Exp. (83), e51088 (2014).
- Boesch, M., et al. DyeCycle Violet used for side population detection is a substrate of P-glycoprotein. Cytometry A. 81 (6), 517-522 (2012).
- Patrawala, L., et al. Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic. Cancer Res. 65 (14), 6207-6219 (2005).
- Guha, P., et al. Nicotine promotes apoptosis resistance of breast cancer cells and enrichment of side population cells with cancer stem cell-like properties via a signaling cascade involving galectin-3, alpha9 nicotinic acetylcholine receptor and STAT3. Breast Cancer Res Treat. 145 (1), 5-22 (2014).
