Методы, позволяющие характеризовать и изолировать популяции стволовых клеток из биологических образцов, имеют решающее значение для продвижения направленного на стволовые клетки лечения рака и других заболеваний. Здесь мы предоставляем подробный протокол для изоляции раковых стволовых клеток, используя фенотип побочной популяции, вызванный красителем.
Рак – это заболевание, вызванное стволовыми клетками, и ликвидация этих клеток стала основной терапевтической целью. Расшифровка уязвимостей раковых стволовых клеток (CSC) и определение подходящих молекулярных мишеней основывается на методах, которые позволяют их специфическую дискриминацию в гетерогенных образцах, таких как клеточные линии и ex vivo опухолевые ткани. Проточная цитометрия / FACS – это мощная технология для многопараметрического рассечения биологических образцов на уровне отдельных клеток и на сегодняшний день является методом выбора для восстановления живых клеток для последующего анализа. Маркеры поверхности, такие как CD44 и CD133, а также определение ферментативной активности альдегиддегидрогеназы часто использовались для определения и сортировки CSCs из образцов опухолей с помощью FACS. Дополнительный подход, описанный здесь в методологических деталях, использует функциональную экструзию красителя транспортерами АВС-лекарств, которая идентифицирует отличную популяцию флуоресцентно-тусклых клеток, обычно называемую боковой популяцией (SP). SPРаковые клетки проявляют канонические характеристики стволовых клеток и могут быть аннулированы и функционально подтверждены с использованием агентов, которые ингибируют экструдирующий краситель экстракт транспортера (чаще всего ABCB1 / P-гликопротеин / MDR1 / CD243 и ABCG2 / Bcrp1 / CD338). Кроме того, SP-анализ совместим с другими проточно-цитометрическими оценками, такими как окрашивание поверхностных антигенов, детекция альдегиддегидрогеназы и различение мертвых клеток ( например , с 7-AAD или иодидом пропидия (PI)). Таким образом, мы описываем ценный и широко применимый метод для идентификации, изоляции и подхарактеристики CSC, механически основанный на функциональном, а не фенотипическом параметре. Несмотря на то, что первоначально Hoechst 33342 был первоначально использован в качестве триггерного красителя, здесь мы сосредоточимся на более позднем фенотипе SP, основанном на фиолетовом красителе, который может быть разрешен на любом проточном цитометре, оснащенном источником фиолетового лазера.
Эффективность первичной онкологической терапии значительно улучшилась за последнее десятилетие благодаря убедительным достижениям в генетическом и молекулярном понимании заболевания и появлению целевых лекарств, таких как терапевтические антитела и ингибиторы малых молекул. Напротив, метастатическая и рецидивирующая заболеваемость по-прежнему обычно неизлечима, а заболеваемость и смертность остаются высокими в этих клинических условиях. CSC представляют четкую субпопуляцию в опухолях и наделены каноническими свойствами стволовых клеток, такими как клоногенность / туморогенность, множественная лекарственная устойчивость и ассиметричное деление клеток 1 , 2 . Таким образом, CSC не только приводят к метастатическому прогрессированию и гетерогенности опухолей, но также сохраняются во время лечения, чтобы предрасположить пациента к рецидиву. Таким образом, терапевтическое удаление CSC является важной медицинской необходимостью для предотвращения рецидива заболевания и долгосрочного лечения рака 3 </suр>.
Идентификация уязвимостей и выяснение стратегий по искоренению CSC сильно зависит от методов, которые позволяют их очищать от биологических образцов для последующего профилирования экспрессии и / или функционального исследования. В свою очередь, такие методы опираются на поверхностные, внутриклеточные или функциональные маркеры, которые являются специфическими для этих клеток. CSC-специфичные поверхностные маркеры включают, но не ограничиваются ими, CD44, CD133, CD24 и CD90 и использовались для идентификации популяций CSC в различных опухолевых образованиях, включая рак молочной железы и рак толстой кишки 4 . Другой маркер, альдегиддегидрогеназа (ALDH), показывает внутриклеточную локализацию и может быть функционально обнаружен, обеспечивая соответствующий субстрат, ферментативное превращение которого вызывает свет. Используя этот тест, популяции CSC были идентифицированы также в разнообразных опухолевых сущностях. 5 . Дополнительный метод, обычно называемый анализом SP и представленный здесь в m Этодологическая деталь, улавливает активный отток красителя транспортерами АВС-препаратов для выявления небольших популяций флуоресцентно-тучных стволоподобных клеток 6 , 7 , 8 . Чтобы достичь этого, данный образец инкубируют в присутствии липофильного ДНК-связывающего флуорофора, который поступает во все клетки через пассивную диффузию и направляет ядерную и митохондриальную ДНК на связывание. Не-CSC, лишенные экспрессии транспортера лекарственного препарата ABC, аккумулируют краситель, приводящий к яркой флуоресценции, тогда как CSC активно экструдируют краситель, который уменьшает флуоресценцию. Фармакологическое ингибирование активности переносчика лекарственных средств отменяет и функционально подтверждает фенотип SP и должно использоваться для контроля. Группы CSC, проявляющие характеристики SP, были описаны, среди прочих, при раке яичников 9 , 10 , раке предстательной железы 11 ,> 12, рак молочной железы 13 , рак легкого 14 , рак эндометрия 15 , глиома 16 , 17 и костная саркома 18 . Важно отметить, что анализ SP совместим как с раковыми клеточными линиями, так и с первичной опухолевой тканью, хотя первичный материал создает дополнительные проблемы, такие как потребность в конкретной стратегии дискриминации опухолевых клеток (некоторые популяции клеток-хозяев также могут проявлять характеристики СП) 19 , 20 ,
Двумя наиболее известными SP-переносчиками наркотиков являются ABCB1 / P-гликопротеин / MDR1 / CD243 и ABCG2 / Bcrp1 / CD338 8 , 9 , 21 ; Однако другие переносчики лекарственных средств могут также быть молекулярным детерминантом фенотипа SP ( например , ABCB5) 22 . ABCB1Может эффективно блокироваться верапамилом, тогда как активность ABCG2 может быть специально аннулирована фумитремонгином C (FTC) 6 , 19 . Особая сила SP-анализа заключается в том, что он может сочетаться с другими окрашиваниями ( например , поверхностными маркерами и ALDH) и что он позволяет восстановление живой клетки, таким образом, совместимым с последующими функциональными исследованиями. Более того, обнаружение SP широко применимо из-за высокой консервации транспортеров ЛСД среди популяций CSC 9 , 23 .
Первоначально детектирование SP было выполнено с использованием Hoechst 33342 в качестве триггерного красителя 24 . Этот краситель достигает превосходного разрешения, но требует возбуждения ультрафиолетовым лазером; Поэтому его применимость, естественно, ограничивается высокоточными проточными цитометрическими приборами. Появление DyeCycle Violet (DCV) 25 открыло новый авенюДля анализа SP и расширил применимость этого метода к стандартным проточным цитометрическим приборам, не имеющим источника ультрафиолетового лазера (источника фиолетового лазера достаточно для разрешения клеток DCV-SP). Важно отметить, что Hoechst 33342 и DCV обладают общими характеристиками насоса, указывая, что либо краситель должен идентифицировать одни и те же популяции клеток.
Здесь мы предоставляем подробный экспериментальный протокол анализа на основе DCV для быстрого и легкого воспроизведения в независимых лабораториях. Таким образом, мы воспринимаем нашу статью как ресурс для исследователей CSC, который должен способствовать оптимизации и стандартизации этого полезного клеточно-биологического метода.
Прогресс в клиническом лечении рака также зависит от развития методов лечения, ориентированных на CSC. Методы, позволяющие надежно изолировать CSC от биологических образцов, ускорят идентификацию подходящих целей и, следовательно, имеют решающее значение в этом начинании. SP-анализ предс…
The authors have nothing to disclose.
Максимилиана Боэша поддерживает Erwin Schrödinger Fellowship из Австрийского фонда науки FWF (грант номер J-3807).
Vybrant DyeCycle Violet | Thermo Fisher Scientific | V35003 | Ready to use |
Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | Dissolve in ethanol |
Fumitremorgin C | Sigma-Aldrich | F9054 | Dissolve in DMSO |
7-AAD (or propidium iodide) | BioLegend | 420403 | Ready to use |
Standard cell culture reagents (e.g., medium, FBS, L-glutamine, antibiotics, PBS, trypsin-EDTA, etc.) | Different suppliers | ||
Sample/cells of interest (e.g., human or murine cancer cell line, human or murine tumor tissue) | Different suppliers | ||
Flow cytometric instrument (analyzer or cell sorter) | Different suppliers | Violet laser source required | |
FACS tubes (round-bottom) | Different suppliers | Tubes with cap recommended | |
70 µm cut-off strainers | Different suppliers | Optional but recommended | |
Digestion enzyme mix (e.g., collagenase/dispase/Dnase) | Different suppliers | Only relevant for tissue dissociation | |
Flurochrome-conjugated antibodies against surface markers of interest | Different suppliers | Optional | |
ALDEFLUOR Kit | STEMCELL Technologies | 01700 | Optional |