Protocolos para investigar a distribuição no tecido hospedeiro, o modo de transmissão e o efeito na aptidão do hospedeiro de um Densovírus na lagarta do algodoeiro
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para investigar a distribuição de tecido hospedeiro, o modo de transmissão, eo efeito sobre a aptidão anfitrião de um densovírus dentro de uma espécie de lepidópteros, a lagarta do algodão. Este protocolo pode também ser utilizado para estudar a interacção entre outros vírus oralmente transmitidos e os seus hospedeiros de insecto.
Abstract
Muitos vírus novos foram descobertos em hospedeiros animais, utilizando tecnologias de sequenciamento de próxima geração. Anteriormente, relatou um vírus mutualistic, Helicoverpa armigera densovírus (HaDV2), em uma espécie de lepidópteros, a lagarta do algodão, Helicoverpa armigera (Hubner). Aqui, descrevemos os protocolos que são atualmente utilizados para estudar o efeito da HaDV2 em seu hospedeiro. Primeiro, estabelecer uma colônia lagarta do algodão livre de HaDV2 partir de um único par de reprodução. Em seguida, por via oral inocular alguns prole das larvas neonato com HaDV2 que contém o líquido filtrado para produzir duas colónias com o mesmo fundo genético: um HaDV2-infectadas, o outro não infectadas. Um protocolo para comparar parâmetros de tabela de vida (por exemplo, larvas, pupas e adultos períodos e fecundidade) entre os indivíduos infectados e HaDV2–uninfected também é apresentada, assim como os protocolos para a determinação da distribuição do tecido hospedeiro e a eficiência de transmissão de HaDV2. Estes protocolos would também ser adequado para investigar os efeitos de outros vírus transmitidos por via oral sobre os seus hospedeiros de insectos lepidópteros, hospedeiros, em particular.
Introduction
Nas últimas décadas, o desenvolvimento da tecnologia de sequenciação, tais como a sequenciação de última geração (NGS) facilitou a descoberta de diversos novos ADN e ARN de vírus, vírus especialmente não patogénicas, mas também novos isolados de vírus anteriormente conhecidas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12. No modelo de organismo de Drosophila melanogaster, mais do que 20 novos genomas virais parciais foram detectadas utilizando técnicas de metagenomic 13. Muitas sequências virais, incluindo novos vírus, também foram identificadas em outros insectos, tais como abelhas, mosquitoes, psilídeos citrinos asiáticos, libélulas, e várias espécies de lepidópteros 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21.
No futuro, pode-se esperar que mais novos vírus vai ser descoberto em insetos usando essas tecnologias avançadas; Assim, a nossa compreensão da interacção hospedeiro-vírus pode mudar de acordo com 6, 9. Por exemplo, as interacções vírus-hospedeiro são considerados para ser mais complicado do que se pensava anteriormente, porque muitos vírus novos estão a ser definida como parceiros mutualistic em vez de agentes patogénicos rígidas 22. Por exemplo, o DplDNV densovírus mutualística em Dysaphis plantaginea induz a metamorfose e alado aumenta a mobilidade, o que facilita a dispersão do hospedeiro, bem como o vírus 23. Além disso, os vírus mutualistas têm sido descritas com relação à saúde dos mamíferos, a seca e tolerância ao frio das plantas, bem como o impacto de infecções bacterianas 24. Seneca vale vírus-001 é mostrado para mediar a citotoxicidade selectiva para células de tumor neuroendócrino com cancro caracteriza 25. Infecções por vírus da hepatite A suprimir a replicação do vírus da hepatite C e podem conduzir a recuperação do vírus da hepatite C 26. Latência herpesvírus confere proteção simbiótica de infecção bacteriana 27. A glicoproteína do envelope do retrovírus humano endógeno HERV-W induz resistência celular ao vírus da necrose do baço 28. Curvularia vírus tolerância térmica (CThTV) a partir de um endófito de fungos está envolvido na interacção entre mutualística este fungo e um grama de pânico tropicalref "> 29. Por isso, o conhecimento das interacções entre os vírus recém-descobertos e seus hospedeiros deve gerar novas perspectivas sobre sua biologia e gestão. No entanto, os novos vírus, especialmente os vírus secretas exibindo sem sinais óbvios típicos de infecção aguda, tem raramente sido investigada, e precisamos de um gasoduto e protocolos para investigar os impactos dos vírus recém-descobertos em seus hospedeiros.
Anteriormente, relataram a prevalência de um novo monosense densovírus Helicoverpa armigera densovírus (HaDV2) na lagarta do algodão, Helicoverpa armigera, e apresentou evidências de uma relação de mutualismo entre HaDV2 ea lagarta do algodão 30, 31. Neste papel, iremos descrever o protocolo laboratorial para estudar em detalhe a interacção entre HaDV2 e seu hospedeiro lagarta do algodão. O protocolo aqui apresentado também pode ser altamente relevante para os pesquisadores que examinam o role de outros vírus oralmente transmissíveis, especialmente em pragas de lepidópteros.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nas últimas poucas décadas, a maioria dos estudos sobre as interacções-virus de insecto têm-se centrado na abelha do mel saúde 34, 35, 36, os vectores de doenças humanas 37, planta vírus 38, e alguns vírus patogénicos de insectos que têm um grande potencial como agentes de controle biológico 39. Pouca atenção tem sido dada ao vírus secretas e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Programa Nacional Key Pesquisa Básica da China (No. 2013CB127602) e do Fundo de Ciência para Grupos pesquisa criativa da National Science Foundation da China (No. 31321004).
Materials
| 24-well plate | Corning | 07-200-740 | Multiple suppliers available. |
| DNA extraction kit | TIANGEN | DP304-03 | Multiple suppliers available. |
| thermal cycler | Veriti; Applied Biosystems | 4375786 | |
| PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 0.22 µm membrane filter | Millipore | SLGS025NB | |
| pEASY-T Cloning Vector | TransGen, Beijing, China | CT301-02 | |
| Tweezers | IDEAL-TEK | 2.SA | |
| Premix Ex Taq (Probe qPCR) | Takara | RR390A | |
| Probes | Invitrogen | Custom order | |
| Primers | Invitrogen | Custom order | |
| microspectrophotometry NanoDrop 2000c | Thermo scientific | not available | |
| 7500 Real-Time PCR system | Applied Biosystems | not available | |
| stereomicroscope SZX-16 | Olympus | not available | |
| sucrose | Multiple suppliers available. | ||
| vitamin complex | Multiple suppliers available. |
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