פרוטוקולים לחקירת הפצת Host-הרקמה, הילוכים-mode, ואת ההשפעה על כושר Host של Densovirus ב bollworm הכותנה
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לחקור את חלוקת מארח-רקמות, מצב שידור, וכן השפעה על כושר המארח של densovirus בתוך מינים פרפראים, את bollworm הכותנה. פרוטוקול זה יכול לשמש גם עבור לימוד האינטראקציה בין וירוסים דרך פה-המשודר אחרים ומארחי החרקים שלהם.
Abstract
וירוסי רומן רבים התגלו מארחי בעלי חיים באמצעות טכנולוגיות רצף של הדור הבא. בעבר, דיווחנו וירוס הדדי, densovirus תנשמית האביב (HaDV2), בעוד מינים פרפראים, את bollworm הכותנה, תנשמית האביב (הובנר). כאן, אנו מתארים את הפרוטוקולים המשמשים כיום כדי לחקור את ההשפעה של HaDV2 על המארח שלו. ראשית, אנו להקים מושבה bollworm כותנה HaDV2 ללא מזוג הרבייה יחיד. ואז, אנחנו בעל פה לחסן כמה צאצאי זחל ילודים עם HaDV2 המכיל נוזל מסונן לייצר שתי מושבות עם אותו הרקע גנטי: אחד HaDV2 נגוע, על אלה שלא נדבקו אחרים. פרוטוקול להשוות פרמטרי שולחן חיים (למשל, זחל, גלמים, ותקופות מבוגרי פוריות) בין יחידים HaDV2 נגועים ואת -uninfected גם מוצג, כמו גם הפרוטוקולים לקביעת חלוקת מארח-רקמות ויעילות העברת HaDV2. פרוטוקולים אלה ווULD גם להיות מתאים חוקר את ההשפעות של וירוסים משודרים אחרים בעל פה על מארחי החרקים שלהם, מארחים פרפראים בפרט.
Introduction
בעשורים האחרונים, את הפיתוח של טכנולוגיית ריצוף כגון סידור הדור הבא (NGS) יש להקל על גילוי וירוסים רבים DNA ו- RNA רומן, במיוחד וירוסים פתוגניים, אבל גם מבודד רומן של וירוסים ידועים בעבר 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12. תסיסנית אורגניזם המודל, יותר מ 20 הגנום וירוס חלקיים חדשים זוהו באמצעות טכניקות metagenomic 13. רצפים ויראלי רבים, כולל וירוסים רומן, גם זוהו חרקים אחרים, כגון דבורים ודבש, מ 'osquitoes, psyllids דר אסיה, שפיריות, ומיני פרפראים מרובים 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21.
בעתיד, ניתן לצפות כי יותר וירוסים רומן יתגלו חרקים באמצעות טכנולוגיות מתקדמות אלה; ומכאן, הבנתנו את אינטראקצית וירוס-מארח עשויה להשתנות בהתאם 6, 9. לדוגמא, אינטראקציות מארח וירוס נחשבות יותר מסובך ממה שחשב בעבר, כי וירוסי רומן רבים מאופיינים כגורם שותפים הדדיים ולא 22 פתוגנים קפדנים. לדוגמא, DplDNV densovirus ההדדי ב plantaginea Dysaphis גורם מורף מכונף מגביר את ניידות, הקלת הפיזור של המארח כמו גם את הווירוס 23. יתר על כן, וירוסים הדדיים תוארו לגבי בריאות יונקת, הבצורת וסובלנות קרה של צמחים, וכן את ההשפעה של זיהומים חיידקיים 24. סנקה העמק וירוס-001 מוצג לתווך cytotoxicity סלקטיבית כלפי תאים סרטניים בסרטן נוירואנדוקריניים כולל 25. הפטיטיס A נגיף לדכא שכפול הפטיטיס C וירוס ועלול להוביל להחלמה מצהבת C 26. חביון ההרפס מקנה הגנה סימביוטית מזיהום חיידקי 27. גליקופרוטאין המעטפה של-W HERV שרטרווירוס האנושי אנדוגני גורם התנגדות הסלולר וירוס נמק הטחול 28. וירוס סובלנות תרמית Curvularia (CThTV) מתוך endophyte פטרייתיים מעורב האינטראקציה ההדדית בין פטרייה זו לבין דשא פאניקה טרופינ"צ "> 29. לפיכך, ידע של האינטראקציות בין הווירוסים מצאו חדש מארחיהם צריכות לייצר נקודות מבט חדשות על הביולוגיה והניהול שלהם. עם זאת, וירוסי רומן, ובמיוחד הווירוסים הסמויים מוצגים שום סימנים ברורים טיפוסיים של זיהום חריף, יש לעיתים רחוקות נחקרו, ואנחנו צריכים צינור ופרוטוקולים כדי לחקור את ההשפעות של וירוסים שנמצאו לאחרונה על מארחיהם.
בעבר, דיווחנו השכיחות חדש monosense densovirus Helicoverpa armigera densovirus (HaDV2) ב bollworm הכותנה, תנשמית האביב, והציגו ראיות של יחסים הדדיים בין HaDV2 ואת כותנת bollworm 30, 31. במאמר זה, נתאר את פרוטוקול המעבדה ללמוד בפירוט את האינטראקציה בין HaDV2 ומארח bollworm הכותנה שלה. הפרוטוקול המובא כאן יכול להיות גם רלוונטי מאוד לחוקרים לבחון את rאולה של וירוסים דרך הפה-המשודר אחרים, במיוחד מזיקים פרפראים.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעשורים האחרונים, רוב המחקרים על אינטראקציות חרקים-וירוס התמקדו בריאות דבש דבורים 34, 35, 36, וקטורים של מחלות אנושיות 37, צמח וירוסי 38, וכמה וירוסים פתוגניים חרקים שיש פוטנציאל גדול כמו סוכנים ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי תכנית המחקר הלאומית מפתח הבסיסי של סין (מס 2013CB127602) וקרן המדע עבור Creative מחקר קבוצות של הקרן הלאומית למדע של סין (מס '31,321,004).
Materials
| 24-well plate | Corning | 07-200-740 | Multiple suppliers available. |
| DNA extraction kit | TIANGEN | DP304-03 | Multiple suppliers available. |
| thermal cycler | Veriti; Applied Biosystems | 4375786 | |
| PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 0.22 µm membrane filter | Millipore | SLGS025NB | |
| pEASY-T Cloning Vector | TransGen, Beijing, China | CT301-02 | |
| Tweezers | IDEAL-TEK | 2.SA | |
| Premix Ex Taq (Probe qPCR) | Takara | RR390A | |
| Probes | Invitrogen | Custom order | |
| Primers | Invitrogen | Custom order | |
| microspectrophotometry NanoDrop 2000c | Thermo scientific | not available | |
| 7500 Real-Time PCR system | Applied Biosystems | not available | |
| stereomicroscope SZX-16 | Olympus | not available | |
| sucrose | Multiple suppliers available. | ||
| vitamin complex | Multiple suppliers available. |
References
- Tang, P., Chiu, C. Metagenomics for the discovery of novel human viruses. Future Microbiol. 5, 177-189 (2010).
- Rosario, K., Breitbart, M. Exploring the viral world through metagenomics. Curr. Opin. Virol. 1, 289-297 (2011).
- Hugenholtz, P., Tyson, G. W. Microbiology – metagenomics. Nature. 455, 481-483 (2008).
- Kristensen, D. M., Mushegian, A. R., Dolja, V. V., Koonin, E. V. New dimensions of the virus world discovered through metagenomics. Trends Microbiol. 18, 11-19 (2010).
- Kleiner, M., Hooper, L. V., Duerkop, B. A. Evaluation of methods to purify virus-like particles for metagenomic sequencing of intestinal viromes. BMC Genomics. 16, 7 (2015).
- Ho, T., Tzanetakis, I. E. Development of a virus detection and discovery pipeline using next generation sequencing. Virology. 471, 54-60 (2014).
- Marx, C. J. Can you sequence ecology? Metagenomics of adaptive diversification. PLoS Biol. 11, e1001487 (2013).
- Radford, A. D., et al. Application of next-generation sequencing technologies in virology. J. Gen. Virol. 93, 1853-1868 (2012).
- Liu, S. J., Chen, Y. T., Bonning, B. C. RNA virus discovery in insects. Curr. Opin. Insect Sci. 8, 54-61 (2015).
- Mokili, J. L., Rohwer, F., Dutilh, B. E. Metagenomics and future perspectives in virus discovery. Curr. Opin. Virol. 2, 63-77 (2012).
- Liu, S. J., Vijayendran, D., Bonning, B. C. Next generation sequencing technologies for insect virus discovery. Viruses-Basel. 3, 1849-1869 (2011).
- Cook, S., et al. Novel virus discovery and genome reconstruction from field RNA samples reveals highly divergent viruses in Dipteran hosts. PLoS ONE. 8, e80720 (2013).
- Webster, C. L., et al. The discovery, distribution, and evolution of viruses associated with Drosophila melanogaster. PLoS Biol. 13, e1002210 (2015).
- Granberg, F., et al. Metagenomic detection of viral pathogens in spanish honeybees: co-infection by aphid lethal paralysis, israel acute paralysis and lake sinai viruses. PLoS ONE. 8, e57459 (2013).
- Runckel, C., et al. Temporal analysis of the honey bee microbiome reveals four novel viruses and seasonal prevalence of known viruses, Nosema, and Crithidia. PLoS ONE. 6, 20656 (2011).
- Cox-Foster, D. L., et al. A metagenomic survey of microbes in honey bee colony collapse disorder. Science. 318, 283-287 (2007).
- Chandler, J. A., Liu, R. M., Bennett, S. N. RNA shotgun metagenomic sequencing of northern California (USA) mosquitoes uncovers viruses, bacteria, and fungi. Front. Microbiol. 6, 185 (2015).
- Shi, C. Y., et al. A metagenomic survey of viral abundance and diversity in mosquitoes from Hubei province. PLoS ONE. 10, e0129845 (2015).
- Nouri, S., Salem, N., Nigg, J. C., Falk, B. W. Diverse array of new viral sequences identified in worldwide populations of the Asian citrus psyllid (Diaphorina citri) using viral metagenomics. J. Virol. 90, 2434-2445 (2016).
- Dayaram, A., et al. Identification of diverse circular single-stranded DNA viruses in adult dragonflies and damselflies (Insecta Odonata) of Arizona and Oklahoma, USA. Infect. Genet. Evol. 30, 278-287 (2015).
- Jakubowska, A. K., et al. Simultaneous occurrence of covert infections with small RNA viruses in the lepidopteran Spodoptera exigua. J.Invert. Pathol. 121, 56-63 (2014).
- Roossinck, M. J. Move over, Bacteria! Viruses make their mark as mutualistic microbial symbionts. J. Virol. 89, 6532-6535 (2015).
- Ryabov, E. V., Keane, G., Naish, N., Evered, C., Winstanley, D. Densovirus induces winged morphs in asexual clones of the rosy apple aphid, Dysaphis plantaginea. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 8465-8470 (2009).
- Roossinck, M. J. The good viruses: viral mutualistic symbioses. Nat. Rev. Microbiol. 9, 99-108 (2011).
- Venkataraman, S., et al. Structure of seneca valley virus-001: an oncolytic picornavirus representing a new genus. Structure. 16, 1555-1561 (2008).
- Deterding, K., et al. Hepatitis a virus infection suppresses hepatitis c virus replication and may lead to clearance of hcv. J. Hepatol. 45, 770-778 (2007).
- Barton, E. S., et al. Herpesvirus latency confers symbiotic protection from bacterial infection. Nature. 447, 326-329 (2007).
- Ponferrada, V. G., Mauck, B. S., Wooley, D. P. The envelope glycoprotein of human endogenous retrovirus herv-w induces cellular resistance to spleen necrosis virus. Arch. Virol. 148, 659-675 (2003).
- Márquez, L. M., Redman, R. S., Rodriguez, R. J., Roossinck, M. J. A virus in a fungus in a plant: three-way symbiosis required for thermal tolerance. Science. 315, 513-515 (2007).
- Xu, P. J., et al. Complete genome sequence of a monosense densovirus infecting the cotton bollworm, Helicoverpa armigera. J. Virol. 86, 10909-10909 (2012).
- Xu, P. J., Liu, Y. Q., Graham, R. I., Wilson, K., Wu, K. M. Densovirus is a mutualistic symbiont of a global crop pest (Helicoverpa armigera) and protects against a baculovirus and Bt biopesticide. PLoS Pathog. 10, e1004490 (2014).
- Liang, G. M., Tan, W. J., Guo, Y. Y. An improvement in the technique of artificial rearing cotton bollworm. Plant Protec. 25, 15-17 (1999).
- Zhou, W. G., Rousset, F., O’Neill, S. Phylogeny and PCR-based classification of Wolbachia strains using wsp gene sequences. P. Roy. Soc. B-Biol. Sci. 265, 509-515 (1998).
- Mondet, F., de Miranda, J. R., Kretzschmar, A., Le Conte, Y., Mercer, A. R. On the front line: quantitative virus dynamics in honeybee (Apis mellifera L.) colonies along a new expansion front of the parasite Varroa destructor. PLoS Pathog. 10, e1004323 (2014).
- Chen, Y. P., et al. Israeli acute paralysis virus: epidemiology, pathogenesis and implications for honey bee health. PLoS Pathog. 10, e1004261 (2014).
- Hunter, W., et al. Large-scale field application of RNAi technology reducing israeli acute paralysis virus disease in honey bees (Apis mellifera, Hymenoptera: Apidae). PLoS Pathog. 6, e1001160 (2010).
- Halstead, S. B. Dengue virus – mosquito interactions. Annu. Rev. Entomol. 53, 273-291 (2008).
- Whitfield, A. E., Falk, B. W., Rotenberg, D. Insect vector-mediated transmission of plant viruses. Virology. 479-480, 278-289 (2015).
- Moscardi, F. Assessment of the application of baculoviruses for control of Lepidoptera. Annu. Rev. Entomol. 44, 257-289 (1999).
- Szelei, J., et al. Susceptibility of North-American and European crickets to Acheta domesticus densovirus (AdDNV) and associated epizootics. J. Invert. Pathol. 106, 394-399 (2011).
