Инвазивные поведение клеток рака молочной железы человека в эмбриональном данио рерио
Summary
Здесь мы опишем ксенотрансплантаты данио модели , используя два различных места инъекций, то есть, перивителлиновое пространство и протоки Кювья, исследовать инвазивное поведение и оценить intravasation и экстравазационный потенциал клеток рака молочной железы человека, соответственно.
Abstract
Во многих случаях, больной раком не умирают от первичной опухоли, а скорее из-за метастаз. Несмотря на многочисленные модели на грызунах доступны для изучения метастазирования рака в естественных условиях, другие эффективные, надежные, недорогие модели необходимы для быстрого доступа потенциальных последствий (эпите) генетических изменения или фармакологических соединений. Таким образом, мы проиллюстрируем и объяснить целесообразность моделей ксенотрансплантата с использованием клеток рака молочной железы человека инжектированной в данио эмбрионов для поддержки этой цели. Под микроскопом, флуоресцентные белки или химически меченые клетки рака молочной железы человека пересаживают в трансгенных эмбрионов данио, Тд (FLI: EGFP), в пространстве или перивителлинового канале Cuvier (Doc) 48 ч после оплодотворения. Вскоре после этого, височно-пространственного процесс инвазии раковых клеток, распространения и метастаза в живом организме рыбы визуализируется под флуоресцентным микроскопом. Модели , использующие различные инъекции сайты, то есть, вivitelline пространство или док дополняют друг друга, что отражает раннюю стадию (intravasation шаг) и поздней стадии (этап экстравазации) в многостадийной метастатического каскада событий. Кроме того, перитуморальный и внутриопухолевый ангиогенез может наблюдаться при инъекции в перивителлиновом пространство. не весь экспериментальный период составляет не более 8 дней. Эти две модели сочетают маркировки клеток, микро-трансплантации, а также методы флуоресцентной визуализации, что позволяет быструю оценку метастазов рака в ответ на генетических и фармакологических манипуляций.
Introduction
Явная метастазы рака в клинике включает в себя ряд сложных и многоступенчатых событий, известных как «метастатического каскада». Каскада была широко рассмотрена и может быть разрезана на последовательные этапы: локальную инвазию, intravasation, распространение, арест, транссудацию и колонизацию 1, 2. Лучшее понимание патогенеза метастазирования рака и развития потенциальных стратегий лечения в естественных условиях необходимы надежные модели , принимающие распространения раковых клеток. Модели грызунов хорошо известны и широко используются для оценки метастаза 3, но эти подходы имеют низкую эффективность и этические ограничения и являются дорогостоящими в качестве модели первого плана , чтобы определить , может ли та или иная манипуляция влияет на метастатический фенотип. Другие модели эффективной, надежной, недорогой, необходимы для быстрого доступа потенциальных последствий (эпи) генетических изменений или pharmacologские соединения. Из – за их высокой генетической гомологии для человека и прозрачности их эмбрионов данио (Danio rerio) возникли в качестве важной модели позвоночных , и все чаще применяются для изучения процессов развития, микроб-хозяин взаимодействий, заболеваний человека, скрининга лекарственных средств и т.д. . 4. Модели метастазирования рака , установленные в данио могут дать ответ на недостатки моделей на грызунах 5, 6.
Хотя спонтанная неоплазия едва видел в дикой данио 7, есть несколько давнишних методы , чтобы вызвать требуемый рак в данио. Вызванного канцероген генных мутации или сигнализация активация пути могут гистологический и молекулярно модель канцерогенез, имитируя заболевание человека в данио 7, 8, 9. По TakING преимущества разнообразно прямые и обратное генетические манипуляции онкогенов или опухолевых супрессоров, (трансгенный) данио также позволил потенциальным исследования формирования и поддержания 6, 10 рака. Индуцированные модели рака в данио охватывают широкий спектр, в том числе пищеварительной, репродуктивной, крови, нервной системы, и эпителиальной 6.
Использование данио в исследовании рака расширилась в последнее время в связи с созданием моделей опухолевых клеток ксенотрансплантата человека в этом организме. Это было впервые сообщено с метастатическими клетками меланомы человека , которые были успешно прижились в данио эмбрионов на стадии бластулы в 2005 году 11. Несколько независимых лаборатории подтверждена целесообразность этой новаторской работы путем введения широкого спектра млекопитающих раковые клеточных линий в данио на различных участках и стадиях развития 5 </ SUP>. Так, например, инъекции вблизи бластодиска и бластоцисты стадии бластулы; инъекции в желточный мешок, перивителлиновое пространства, протоков Кювье (Doc), и задней кардинальной вены 6-H- до 5-дневных эмбрионов; и инъекция в брюшную полость 30-дневных личинок иммуносупрессии была проведена 5, 12. Кроме того, аллогенных трансплантаций опухоли также были представлены в данио 12, 13. Одно из самых больших преимуществ использования ксенотрансплантатов является то, что привиты раковые клетки могут быть легко флуоресцентно меченных и отличаются от нормальных клеток. Следовательно, расследование динамических поведения формирования microtumor 14, инвазию и метастазирование клеток 15, 16, 17, 15 ангиогенез , индуцированный опухолью, 18, а также взаимодействие между раковыми клетками и хозяином факторами 17 могут быть четко визуализируются в живом организме рыбы, особенно , когда трансгенные линии данио применяется 5.
Вдохновленный высоким потенциалом данио моделей ксенотрансплантатов оценить метастазирование, мы продемонстрировали transvascular Экстравазационным свойства различных клеточных линий рака молочной железы в области tailfin от Tg (FLI: EGFP) эмбрионов данио рерио через Doc инъекций 16. Роль трансформирующий фактор роста-бета (TGF-бета) 16 и костного морфогенетического белка (BMP) 19 сигнальных путей в про- / анти-молочной инвазии и метастазирование раковых клеток также были исследованы в этой модели. Кроме того, мы также перечислил основные направления intravasation способность различных клеток рака молочной железы линий в обращении с использованием ксенотрансплантатов данио модели с перивителлиновом космических инъекций.
<p claсс = «jove_content»> В этой статье представлены подробные протоколы для данио ксенотрансплантатных моделей, основанных на инъекции клеток рака молочной железы человека в перивителлиновое пространство или Док. С помощью флуоресцентной визуализации с высоким разрешением, мы показываем представительный процесс intravasation в кровеносные сосуды и инвазивного поведение различных клеток рака молочной железы человека, которые перемещаются из кровеносных сосудов в аваскулярную области tailfin.Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описали два метода для исследования инвазивного поведения клеток рака молочной железы в Tg (FLI1: EGFP) эмбрионы данио, с перивителлиновым пространства и Doc инъекциями. Вводя раковые клетки, меченные химическим красителем или флуоресцентного белка в трансгенных эмбрионов дани…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследования членов семьи TGF-β поддерживаются Cancer Genomics центр Нидерландов. Сиджия Лиу и Цзян Ren поддержаны Советом Стипендии Китая в течение 4 лет обучения в университете Лейдена. Мы благодарим доктора Фред Миллер (Барбара Энн Karmanos институт рака, Детройт, Мичиган, США) для клеточных линий MCF10A.
Materials
| Agarose | MP Biomedicals | AGAF0500 | |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus | 300038 | |
| Cholera enterotoxin | Calbiochem | 227035 | |
| Confocal microscope | Leica | SP5 STED | |
| DMEM-high glucose media containing L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMEM/F-12 media containing L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 21041025 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools Inc | 11252-20 | |
| Epidermal growth factor | Merck Millipore | 01-107 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 16140071 | |
| Fluorescent stereo microscope | Leica | M165 FC | |
| HEK293T cell line | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| Hydrocortisone | SigmaAldrich | 227035 | |
| Horse serum | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
| Insulin | SigmaAldrich | I-6634 | |
| MCF10A (M1) cell line | Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) | ||
| MCF10Aras (M2) cell line | Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) | ||
| MDA-MB-231 cell line | American Type Culture Collection | CRM-HTB-26 | |
| Manual micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Wide-tip Pasteur pipette (0,5-20 ul) | Eppendorf | F276456I | |
| pCMV-VSVG plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| PLV-mCherry plasmid | Addgene | 36084 | |
| pMDLg-RRE (gag/pol) plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Houben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Pneumatic picoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| Polybrene | SigmaAldrich | 107689 | |
| Prism 4 software | GraphPad Software | ||
| pRSV-REV plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Stereo microscope | Leica | MZ16FA | |
| Tg (fli:EGFP) zebrafish strain | Kindly provided by Dr. Ewa Snaar-Jagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands) | ||
| Tris-base | SigmaAldrich | 11814273001 | |
| Tricaine (3-aminobenzoic acid) | SigmaAldrich | A-5040 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | ThermoFisher Scientific | 15400054 | |
| Petri dishes, polystyrene (60 × 15 mm) | SigmaAldrich | P5481-500EA | |
| Polystyrene dish with glass bottom | WillCo | GWST-5040 |
References
- Wan, L., Pantel, K., Kang, Y. Tumor metastasis: moving new biological insights into the clinic. Nat. Med. 19 (11), 1450-1464 (2013).
- Obenauf, A. C., Massagué, J. Surviving at a distance: Organ-specific metastasis. Trends Cancer. 1 (1), 76-91 (2015).
- Saxena, M., Christofori, G. Rebuilding cancer metastasis in the mouse. Mol. Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).
- Teng, Y., Xie, X., Walker, S., et al. Evaluating human cancer cell metastasis in zebrafish. BMC cancer. 13 (1), 453 (2013).
- Konantz, M., Balci, T. B., Hartwig, U. F., et al. Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer. Ann N Y Acad Sci. 1266 (1), 124-137 (2012).
- Zhao, S., Huang, J., Ye, J. A fresh look at zebrafish from the perspective of cancer research. J Exp Clin Cancer Res. 34 (1), 80 (2015).
- Stanton, M. F. Diethylnitrosamine-induced hepatic degeneration and neoplasia in the aquarium fish, Brachydanio rerio. J. Natl. Cancer Inst. 34 (1), 117-130 (1965).
- Lam, S. H., Wu, Y. L., Vega, V. B., et al. Conservation of gene expression signatures between zebrafish and human liver tumors and tumor progression. Nat. Biotechnol. 24 (1), 73-75 (2006).
- Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research-advantages and current limitations. Toxicol. Pathol. 31, 62-87 (2003).
- Stoletov, K., Klemke, R. Catch of the day: zebrafish as a human cancer model. Oncogene. 27 (33), 4509-4520 (2008).
- Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., et al. The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation. Dev. Dynam. 233 (4), 1560-1570 (2005).
- Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat. Protoc. 5 (3), 383-394 (2010).
- Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer Res. 66 (6), 3120-3125 (2006).
- Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., et al. High-resolution imaging of the dynamic tumor cell-vascular interface in transparent zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (44), 17406-17411 (2007).
- Rouhi, P., Jensen, L. D., Cao, Z., et al. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Nat. Protoc. 5 (12), 1911-1918 (2010).
- Drabsch, Y., He, S., Zhang, L., et al. Transforming growth factor-β signalling controls human breast cancer metastasis in a zebrafish xenograft model. Breast Cancer Res. 15 (6), R106 (2013).
- He, S., Lamers, G. E., Beenakker, J. W., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J. Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).
- Nicoli, S., Presta, M. The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay. Nat. Protoc. 2 (11), 2918-2923 (2007).
- de Boeck, M., Cui, C., Mulder, A. A., et al. Smad6 determines BMP-regulated invasive behaviour of breast cancer cells in a zebrafish xenograft model. Sci. Rep. 6, 24968 (2016).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
- Stewart, S. A., Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9 (4), 493-501 (2003).
- Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J. Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. Arteries and veins: making a difference with zebrafish. Nat. Rev. Genet. 3 (9), 674-682 (2002).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nat. Rev. Drug Discov. 4 (1), 35-44 (2005).
