Aqui, descrevemos modelos peixe-zebra xenotransplante usando dois locais de injecção diferentes, ou seja, espaço perivitelínico e duto de Cuvier, para investigar o comportamento invasivo e avaliar a intravasation e extravasamento potencial das células de câncer de mama humanos, respectivamente.
Em muitos casos, pacientes com câncer não morrer de um tumor primário, mas sim por causa da metástase. Embora numerosos modelos de roedores estão disponíveis para estudar a metástase do cancro in vivo, outros modelos eficientes, fiáveis e de baixo custo são necessários para aceder rapidamente os efeitos potenciais de (epi) alterações genéticas ou compostos farmacológicos. Como tal, nós ilustrar e explicar a viabilidade de modelos de xenoenxerto utilizando células de cancro da mama humanas injectadas em embriões de peixe-zebra para suportar este objectivo. Sob o microscópio, proteínas fluorescentes ou células de cancro da mama humano quimicamente marcados são transplantadas em embriões de peixes-zebra transgénicos, Tg (fli: EGFP), no espaço perivitelino ou ducto de Cuvier (DOC) 48 h após a fertilização. Pouco depois, o processo temporal-espacial da invasão da célula cancerosa, disseminação e metástase no corpo do peixe vivo é visualizada sob um microscópio fluorescente. Os modelos que utilizam diferentes locais de injecção, isto é, porespaço ivitelline ou doe são complementares um ao outro, o que reflecte a fase inicial (passo intravasamento) e fase tardia (passo extravasamento) da cascata metastática de várias etapas de eventos. Além disso, a angiogénese peritumoral e intratumoral pode ser observada com a injecção no espaço perivitelino. O período experimental todo não mais do que 8 dias é. Estes dois modelos combinam marcação celular, micro-transplante, e as técnicas de imagiologia de fluorescência, permitindo a avaliação rápida de metástase do cancro em resposta a manipulações genéticas e farmacológicas.
metástase do cancro manifesta na clínica compreende uma série de eventos complexos e multi-passo conhecido como o "cascata metastática". A cascata tem sido extensivamente revisado e pode ser dissecado em etapas sucessivas: a invasão local, intravasation, difusão, Detenção, extravasamento e colonização 1, 2. Uma melhor compreensão da patogênese da metástase do câncer e o desenvolvimento de potenciais estratégias de tratamento in vivo requerem modelos de acolhimento robustas de disseminação de células cancerígenas. Modelos de roedores estão bem estabelecidos e são largamente utilizados para avaliar a metástase 3, mas estas abordagens têm baixa eficiência e limitações éticos e são dispendiosos como um modelo de vanguarda para determinar se uma manipulação particular poderia afectar o fenótipo metastático. Outros modelos eficaz, fiável e de baixo custo são necessários para aceder rapidamente os efeitos potenciais de (epi) alterações genéticas ou pharmacologcompostos ical. Devido à sua elevada homologia genética para os seres humanos e a transparência da sua embriões de peixe-zebra (Danio rerio) têm emergido como uma importante modelo de vertebrado e estão a ser cada vez mais aplicada ao estudo de processos de desenvolvimento, interacções micróbio-hospedeiro, doenças humanas, o rastreio de fmacos, etc. . 4. Os modelos de metástase cancerosa estabelecidos no peixe-zebra pode proporcionar uma resposta às deficiências dos modelos de roedores 5, 6.
Embora neoplasia espontânea é dificilmente visto em peixes-zebra selvagem 7, existem várias técnicas de longa data para induzir o cancro desejado em peixes-zebra. Mutações de genes induzida por carcinogénico ou activação da via de sinalização pode histologicamente e carcinogénese modelo molecularmente, simulando doença humana em peixes-zebra 7, 8, 9. por taking vantagem de diverso para a frente e reverso manipulações genéticas de oncogenes ou supressores de tumor, (transgénicos) do peixe-zebra também permitiram potenciais estudos de formação e de manutenção 6, 10 cancro. Os modelos de cancro induzidos em peixes-zebra cobrir um largo espectro, incluindo digestivo, reprodutivo, sangue, sistema nervoso, epitelial e 6.
A utilização do peixe-zebra na pesquisa do câncer recentemente expandiu devido ao estabelecimento de modelos de xenotransplante de células tumorais humanas neste organismo. Este foi relatada pela primeira vez com células de melanoma humano metastático que foram enxertadas com sucesso em embriões de peixe zebra na fase de blástula em 2005 11. Vários laboratórios independentes validada a viabilidade deste trabalho pioneiro através da introdução de uma grande variedade de linhas de células cancerosas de mamífero em peixes-zebra em vários locais e estágios de desenvolvimento 5 </ Sup>. Por exemplo, injecções perto do blastodisco e blastocisto da fase de blástula; injecções no saco vitelino, espaço perivitelino, ducto de Cuvier (DOC), e veia cardinal posterior de 6-h- de embriões de 5 dias de idade; e injecções na cavidade peritoneal de larvas imunossuprimidos de 30 dias de idade, foram realizados 5, 12. Adicionalmente, os transplantes de tumor alogénico também foram relatados em peixes-zebra 12, 13. Uma das grandes vantagens da utilização de xenoenxertos é que as células cancerosas enxertada pode ser facilmente marcado por fluorescência e distinguido a partir de células normais. Por conseguinte, as investigações sobre os comportamentos dinâmicos de formação microtumor 14, a invasão de células e metástase 15, 16, 17, a angiogénese induzida por tumores 15, 18, e as interacções entre as células cancerosas e factores do hospedeiro 17 pode ser claramente visualizada no corpo do peixe vivo, especialmente quando as linhas de peixes-zebra transgénicos são aplicados 5.
Inspirado pelo alto potencial de modelos de xenoenxerto de peixe-zebra para avaliar metástases, que demonstraram as propriedades de extravasamento transvascular de diferentes linhas celulares de cancro da mama na área de tailfin de Tg (fli: EGFP) embriões de peixe-zebra através de injecções Doc 16. O papel do factor de crescimento transformante-β (TGF-β) proteína de 16 e osso morfogenética (BMP) 19 vias de sinalização na invasão de células de cancro da pró / anti-mama e de metástases foram também investigados neste modelo. Além disso, também a capacidade recapitulado intravasamento de várias linhas celulares de cancro da mama em circulação, utilizando modelos de xenoenxerto de peixe-zebra com injecções espaço perivitelino.
<p class = "jove_content"> Este artigo apresenta protocolos detalhados para os modelos de xenotransplante de peixe-zebra com base na injeção de células de câncer de mama humanos para o espaço perivitelínico ou Doc. Utilizando imagiologia de fluorescência de alta resolução, que mostram o processo representativo de intravasamento em vasos sanguíneos e o comportamento invasivo de diferentes células de cancro da mama humano, que se movem a partir dos vasos sanguíneos na área tailfin avascular.Aqui, são descritos dois métodos para investigar o comportamento invasivo das células cancerosas da mama em Tg (FLI1: EGFP) embriões de peixe-zebra, com espaço perivitelino e Doc injecções. Através da injecção de células cancerosas marcadas com corante químico ou proteína fluorescente em embriões de peixes-zebra transgénicos, as características dinâmicas e espaciais de invasão e metástase pode ser claramente rastreados em tempo real na parte de uma única célula ou nível de agregados sob um…
The authors have nothing to disclose.
Estudos sobre os membros da família TGF-β são suportados pelo Cancer Genomics Centro Holanda. Sijia Liu e Jiang Ren são suportadas pelo Conselho Scholarship China para 4 anos de estudo na Universidade de Leiden. Agradecemos ao Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, EUA) para as linhas celulares MCF10A.
Agarose | MP Biomedicals | AGAF0500 | |
Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus | 300038 | |
Cholera enterotoxin | Calbiochem | 227035 | |
Confocal microscope | Leica | SP5 STED | |
DMEM-high glucose media containing L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
DMEM/F-12 media containing L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 21041025 | |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools Inc | 11252-20 | |
Epidermal growth factor | Merck Millipore | 01-107 | |
Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 16140071 | |
Fluorescent stereo microscope | Leica | M165 FC | |
HEK293T cell line | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
Hydrocortisone | SigmaAldrich | 227035 | |
Horse serum | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
Insulin | SigmaAldrich | I-6634 | |
MCF10A (M1) cell line | Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) | ||
MCF10Aras (M2) cell line | Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) | ||
MDA-MB-231 cell line | American Type Culture Collection | CRM-HTB-26 | |
Manual micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
Micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
Wide-tip Pasteur pipette (0,5-20 ul) | Eppendorf | F276456I | |
pCMV-VSVG plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
PLV-mCherry plasmid | Addgene | 36084 | |
pMDLg-RRE (gag/pol) plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Houben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
Pneumatic picoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
Polybrene | SigmaAldrich | 107689 | |
Prism 4 software | GraphPad Software | ||
pRSV-REV plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
Stereo microscope | Leica | MZ16FA | |
Tg (fli:EGFP) zebrafish strain | Kindly provided by Dr. Ewa Snaar-Jagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands) | ||
Tris-base | SigmaAldrich | 11814273001 | |
Tricaine (3-aminobenzoic acid) | SigmaAldrich | A-5040 | |
Trypsin-EDTA (0.5%) | ThermoFisher Scientific | 15400054 | |
Petri dishes, polystyrene (60 × 15 mm) | SigmaAldrich | P5481-500EA | |
Polystyrene dish with glass bottom | WillCo | GWST-5040 |