胚ゼブラフィッシュにおけるヒト乳癌細胞の浸潤挙動
Summary
ここでは、侵襲的な行動を調査し、それぞれ、ヒト乳癌細胞の脈管内および血管外漏出の可能性を評価するために、二つの異なる注射部位、 すなわち、卵黄周囲のスペースとキュビエのダクトを使用して異種移植ゼブラフィッシュモデルを記述します。
Abstract
多くの場合、癌患者は、原発腫瘍で死ぬのではなく、理由転移のしないでください。多数のげっ歯類モデルは、in vivoで癌転移を研究するために利用可能であるが、他の効率的な、信頼性の高い、低コストのモデルはすぐに（エピ）の遺伝的変化または薬理学的化合物の潜在的な効果にアクセスするために必要とされています。そのため、我々は説明し、この目標をサポートするために、ゼブラフィッシュの胚に注入ヒト乳癌細胞を用いた異種移植モデルの実現可能性を説明します。顕微鏡下で、蛍光タンパク質または化学的に標識されたヒト乳癌細胞は、トランスジェニックゼブラフィッシュ胚に移植され、Tgは（FLI：EGFP）、48時間受精後囲卵腔またはキュビエ（DOC）のダクトに。まもなくして、生きている魚の体内の癌細胞の浸潤、普及、および転移の時間的・空間的なプロセスは、蛍光顕微鏡下で可視化されます。別の注射部位を使用したモデル、 すなわち、あたりivitellineスペースまたはドキュメントは、イベントの多段階転移カスケードの初期段階（血管内のステップ）及び後期（血管外遊出ステップ）を反映し、互いに相補的です。また、腫瘍周囲および腫瘍内血管新生は囲卵腔への注射を用いて観察することができます。全実験期間は、これ以上の8日未満です。これらの2つのモデルが、遺伝的および薬理学的操作に応じて、癌転移の迅速な評価を可能にする、細胞標識、マイクロ移植、および蛍光イメージング技術を兼ね備えています。
Introduction
クリニックでの明白な癌の転移は「転移カスケード」として知られ、複雑で多段階の一連のイベントを含みます。カスケードは広く概説されており、連続したステップに解剖することができます：局所浸潤、脈管内、普及、逮捕、血管外漏出、および植民地化1、2。癌転移の病因の理解とin vivoでの潜在的な治療戦略の開発は、癌細胞の広がりの強力なホストモデルが必要です。げっ歯類のモデルは十分に確立され、広く転移3を評価するために使用されているが、これらのアプローチは、低効率性と倫理的な限界があり、特定の操作が転移性の表現型に影響を与える可能性があるかどうかを判断するために最先端モデルとして高価です。その他の効率的な、信頼性の高い、低コストのモデルはすぐに（エピ）遺伝的変化やpharmacologの潜在的な影響へのアクセスに必要なiCalの化合物。その高い遺伝ヒトに対する相同性およびその胚のゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ）の透明性に重要な脊椎動物のモデルとして浮上していると、ますます発達プロセス、微生物宿主相互作用、ヒトの疾患、薬物スクリーニングなどの研究に適用されています。4。ゼブラフィッシュに設立された癌転移モデルは、齧歯類モデル5、6の欠点に対する答えを提供することができます。
自発的新生物はほとんど野生ゼブラフィッシュ7に見られないが、ゼブラフィッシュにおいて所望癌を誘発するためのいくつかの長年の技術があります。発癌物質誘発性の遺伝子突然変異またはシグナル伝達経路の活性化は、組織学的および分子モデル発癌、ゼブラフィッシュ7、8、9、ヒト疾患を模倣することができます。 TAKにより、前方多様の利点をすると、癌遺伝子または腫瘍抑制因子の遺伝子操作を逆に、（遺伝子組換え）ゼブラフィッシュまた、癌の形成と維持6、10の潜在的な研究を有効にしています。ゼブラフィッシュにおける誘導癌モデルは、消化器、生殖、血液、神経系、および上皮6を含む広いスペクトルをカバーしています。
癌研究におけるゼブラフィッシュの利用はこれによる生物におけるヒト腫瘍細胞の異種移植モデルの確立に最近拡大しています。これは、最初に成功した2005年11胞胚段階でゼブラフィッシュの胚に移植したヒト転移メラノーマ細胞で報告されました。いくつかの独立した研究室では、様々なサイトや発達段階でゼブラフィッシュへの哺乳動物の癌細胞株の多様な範囲を導入することで、この先駆的な仕事の実現可能性を検証してきた5 </ SUP>。例えば、胚盤および胞胚期の胚盤胞の近くに注射します。 5日齢の胚に卵黄嚢、卵黄周囲スペース、キュビエ（DOC）のダクト、及び6-H-の後部主静脈への注射;および30日齢の免疫抑制幼虫の腹腔内への注射は、5、12を行ってきました。また、同種異系腫瘍移植もゼブラフィッシュ12、13で報告されました。異種移植片を使用しての大きな利点の一つは、移植された癌細胞が簡単に蛍光標識し、正常細胞と区別することができるということです。したがって、microtumor形成14、細胞浸潤および転移15、16、17、腫瘍誘導血管形成15、1の動的挙動の調査8、および癌細胞とホスト間の相互作用は、トランスジェニックゼブラフィッシュの行は5に適用されている場合は特に、17は明らかに生きた魚の体に可視化することができる要因。
ドク注射〜16ゼブラフィッシュの胚：転移を評価するために、ゼブラフィッシュ異種移植モデルの高電位に触発され、我々は、Tgは（EGFP FLI）の尾翼領域に異なる乳癌細胞株の経血管外遊出の性質を示しました。プロ/抗乳癌細胞の浸潤や転移におけるトランスフォーミング増殖因子βの役割（TGF-β）16と、骨形成タンパク質（BMP）19のシグナル伝達経路はまた、このモデルで検討しました。また、我々はまた、卵黄周囲スペース注射で異種移植ゼブラフィッシュモデルを使用して循環に様々な乳癌細胞株の脈管内の能力を再現し。
<p classは=「jove_content」>この記事では、囲卵腔またはドキュメントへのヒト乳癌細胞の注入に基づいて、ゼブラフィッシュの異種移植モデルのための詳細なプロトコルを提示します。高分解能蛍光イメージングを使用して、我々は無血管尾翼領域に血管から移動した血管と異なるヒト乳癌細胞の浸潤性行動、に脈管内の代表的なプロセスを示しています。Protocol
Representative Results
Discussion
囲卵腔とドク注射でゼブラフィッシュ胚、：ここでは、Tgは（EGFP FLI1）における乳癌細胞の浸潤性の挙動を調査するために二つの方法を説明しました。トランスジェニックゼブラフィッシュ胚に化学色素または蛍光タンパク質で標識された癌細胞を注入することにより、浸潤および転移の動的及び空間特性は、明らかに蛍光顕微鏡下で単細胞またはクラスタレベルでリアルタイ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TGF-βファミリーのメンバーの研究は、がんゲノム解析センターオランダでサポートされています。シジア・リューと江漣はライデン大学の研究の4年間の中国奨学金委員会によってサポートされています。私たちは、MCF10A細胞株のために博士フレッド・ミラー（バーバラ・アン・カルマノス癌研究所、デトロイト、MI、USA）を感謝します。
Materials
| Agarose | MP Biomedicals | AGAF0500 | |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus | 300038 | |
| Cholera enterotoxin | Calbiochem | 227035 | |
| Confocal microscope | Leica | SP5 STED | |
| DMEM-high glucose media containing L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMEM/F-12 media containing L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 21041025 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools Inc | 11252-20 | |
| Epidermal growth factor | Merck Millipore | 01-107 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 16140071 | |
| Fluorescent stereo microscope | Leica | M165 FC | |
| HEK293T cell line | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| Hydrocortisone | SigmaAldrich | 227035 | |
| Horse serum | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
| Insulin | SigmaAldrich | I-6634 | |
| MCF10A (M1) cell line | Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) | ||
| MCF10Aras (M2) cell line | Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) | ||
| MDA-MB-231 cell line | American Type Culture Collection | CRM-HTB-26 | |
| Manual micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Wide-tip Pasteur pipette (0,5-20 ul) | Eppendorf | F276456I | |
| pCMV-VSVG plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| PLV-mCherry plasmid | Addgene | 36084 | |
| pMDLg-RRE (gag/pol) plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Houben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Pneumatic picoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| Polybrene | SigmaAldrich | 107689 | |
| Prism 4 software | GraphPad Software | ||
| pRSV-REV plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Stereo microscope | Leica | MZ16FA | |
| Tg (fli:EGFP) zebrafish strain | Kindly provided by Dr. Ewa Snaar-Jagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands) | ||
| Tris-base | SigmaAldrich | 11814273001 | |
| Tricaine (3-aminobenzoic acid) | SigmaAldrich | A-5040 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | ThermoFisher Scientific | 15400054 | |
| Petri dishes, polystyrene (60 × 15 mm) | SigmaAldrich | P5481-500EA | |
| Polystyrene dish with glass bottom | WillCo | GWST-5040 |
References
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