כאן, אנו מתארים דגמים דג הזברה xenograft באמצעות שני אתרים הזרקה שונים, כלומר, חלל צינור perivitelline של קיביה, כדי לחקור את התנהגות פולשנית ולהעריך את הפוטנציאל intravasation ו extravasation של תאי סרטן שד אנושיים, בהתאמה.
במקרים רבים, חולי הסרטן אינם מתים של גידול ראשוני, אלא בגלל גרורות. למרות במודלים של מכרסמים רבים זמינים לחקר גרורות סרטן in vivo, מודלים יעילים, אמינים, בעלות נמוכה אחרים נדרשים לגשת ההשפעות הפוטנציאליות במהירות של (EPI) שינויים גנטיים או תרכובות תרופתיות. ככזה, אנו מדגימים ומסבירים את ההיתכנות של מודלים xenograft באמצעות תאי סרטן שד אנושיים מוזרק לתוך עוברי דג הזברה כדי לתמוך ביעד זה. תחת מיקרוסקופ, חלבוני ניאון או תאי סרטן שד אנושיים שכותרתו כימית מושתלים לתוך עוברי דג הזברה מהונדס, Tg (FLI: EGFP), על שטח perivitelline או צינור של קיביה (דוק) 48 שעות לאחר ההפריה. זמן קצר לאחר מכן, בתהליך הזמן- מרחב של פלישת תאים סרטניים, הפצה, וגרורה בגוף דגי החיים הוא דמיין תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. המודלים באמצעות מוזרקים שונים, כלומר, לכלשטח או דוק ivitelline הם משלימים אחד את השני, המשקף את השלב המוקדם (שלב intravasation) ושלב מאוחר (שלב extravasation) של מפל גרורתי רב שלבי של אירועים. יתר על כן, אנגיוגנזה peritumoral ו intratumoral ניתן לצפות עם הזרקה לתוך שטח perivitelline. תקופת הניסוי כולו הוא לא יותר מ 8 ימים. שני המודלים הללו משלבים תיוג תא, מייקרו-להשתלה, וטכניקות דימות פלואורסצנטי, המאפשרים ההערכה המהירה של גרורות סרטן בתגובת מניפולציות גנטיות תרופתיות.
גרורות סרטן גלויות המרפאה כוללות סדרה של אירועים מורכבים ורב-צעד המכונים "המפל גרורתי". האשד נבדק בהרחבה ניתנת גזור לתוך צעדים רצופים: פלישה מקומית, intravasation, הפצה, מעצר, extravasation, והקולוניזציה 1, 2. הבנה טובה יותר של הפתוגנזה של גרורות סרטן לבין ההתפתחות של אסטרטגיות טיפול פוטנציאל in vivo דורשת מודלים מארחים חזקים של התפשטות תאים סרטניים. מודלים מכרסמים מבוססים היטב והם בשימוש נרחב כדי להעריך גרורות 3, אך גישות אלה יש יעילות נמוכה ומגבלות אתיות והם יקרים כמודל חנית כדי לקבוע אם מניפולציה מסוימת יכולה להשפיע על הפנוטיפ גרורתי. מודלים יעיל, אמינה, בעלות נמוכה אחרים נדרשים לגשת ההשפעות הפוטנציאליות במהירות של (EPI) שינויים גנטיים או pharmacologתרכובות iCal. בשל ההומולוגיה הגנטית הגבוהה שלהם לבני אדם ואת השקיפות של דג הזברה עוברת שלהם (Danio rerio) צמח כמודל החולייתנים חשוב מיושמים ויותר בחקר תהליכים התפתחותיים, אינטראקציות החיידק-host, מחלות אנושיות, הקרנת סמים, וכו ' . 4. המודלים הגרורים הסרטן הוקמו בשנת דג זברה עשויים לספק תשובה לחסרונות של מודלים מכרסמים 5, 6.
למרות neoplasia הספונטנית נתפסת בקושי דג הזברה פרא 7, קיימים מספר טכניקות ארוכות שנים לגרום לסרטן רצוי דג הזברה. מוטציות גנטיות המושרה Carcinogen או הפעלת מסלול איתות יכול היסטולוגית ו סרטן מודל מולקולרי, מחקה מחלות אנושיות דג הזברה 7, 8, 9. By טאקing יתרון של מגוון קדימה לאחור מניפולציות גנטיות של אונקוגנים או מדכאי גידול, (מהונדס) דג זברה גם אפשרה מחקרים הפוטנציאל של היווצרות הסרטן ותחזוקה 6, 10. מודלי סרטן מושרה דג הזברה לכסות ספקטרום רחב, כולל עיכול, רבייה, דם, מערכת עצבים, וכן האפיתל 6.
הניצול של דג זברה בחקר הסרטן הרחיב לאחרונה בשל הקמת מודלי xenograft התא אנושיים גידולים אורגניזם זה. זה דווח לראשונה עם תאי מלנומה גרורתית אדם שהיו engrafted בהצלחה עוברי דג הזברה בשלב blastula ב 2005 11. מעבדות עצמאיות כמה אימתו את הכדאיות של עבודה חלוצית זו על ידי הצגת מגוון רחב של קווי תאים סרטניים יונקים לתוך דג הזברה באתרים שונים בשלבים התפתחותיים 5 </ Sup>. לדוגמה, זריקות ליד blastodisc ו הבלסטוציסט הבמה blastula; זריקות לתוך שק החלמון, מרחב perivitelline, צינור של קיביה (דוק), וריד הקרדינל האחורי של 6-H- עוברי 5 ימים בת; וזריקות לתוך חלל הצפק של זחלי immunosuppressed בן 30 ימים בוצעו 5, 12. בנוסף, השתלות גידול אלוגנאית גם דווחו דג הזברה 12, 13. אחד היתרונות הגדולים של שימוש xenografts היא כי תאי סרטן engrafted יכול להיות שכותרתו fluorescently בקלות ומכובדת לתאים נורמליים. לפיכך, חקירות לתוך ההתנהגויות הדינמיות של היווצרות microtumor 14, פלישת תא וגרורות 15, 16, 17, אנגיוגנזה מושרה גידולים 15, 1 8, ואת יחסי הגומלין בין תאים סרטניים לבין המארח גורמי 17 ניתן דמיינו בבירור בגוף דגים חיים, במיוחד כאשר קווי דג הזברה מהונדס מוחלים 5.
בהשראת הפוטנציאל הגבוה של מודלי xenograft דג זברה להעריך גרורות, הראינו את מאפייני extravasation transvascular של שורות תאי סרטן השד שונות באזור הסנפיר של Tg (FLI: EGFP) עוברי דג זברה דרך זריקות דוק 16. תפקידו של הפיכת גורם גדילה-β (TGF-β) 16 ועצם חלבון המוךפו"גנטי שהולך (BMP) 19 מסלולי איתות הפלישה תאים סרטניים פרו / אנטי-שד וגרורות נחקרו גם במודל זה. יתר על כן, אנחנו גם סיכם את היכולת intravasation של שורות תאים סרטניים שונים השד למחזור באמצעות מודלים דג הזברה xenograft עם זריקות מרחב perivitelline.
<p class = "jove_content"> מאמר זה מציג פרוטוקולים מפורטים דגמי xenograft דג הזברה מבוסס על הזרקה של תאי סרטן שד אנושיים לחלל perivitelline או דוק. באמצעות דימות פלואורסצנטי ברזולוציה גבוהה, אנו מציגים את תהליך נציג intravasation לתוך כלי דם ואת ההתנהגות פולשנית של תאים סרטניים בשד אנושיים שונים, אשר עוברים כלי הדם לאזור סנפיר avascular.הנה, תיארנו שתי שיטות לחקור את התנהגות פולשנית של תאים סרטניים בשד ב Tg (fli1: EGFP) עוברי דג הזברה, עם זריקות מרחב perivitelline ו דוק. באמצעות הזרקת תאי סרטן שכותרתו עם צבע כימי או חלבון פלואורסצנטי לתוך עוברי דג זברה מהונדסים, המאפיינים הדינמיים המרחבי של פלישה גרורה ניתן ל…
The authors have nothing to disclose.
מחקרים על בני המשפחה-β TGF נתמכים על ידי הולנד המרכז Genomics סרטן. Sijia ליו ג'יאנג רן נתמכים על ידי המועצה מלגות סין עבור 4 שנות לימוד באוניברסיטת ליידן. אנו מודים לד"ר פרד מילר (ברברה אן Karmanos מכון הסרטן, דטרויט, מישיגן, ארה"ב) עבור שורות תאים MCF10A.
Agarose | MP Biomedicals | AGAF0500 | |
Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus | 300038 | |
Cholera enterotoxin | Calbiochem | 227035 | |
Confocal microscope | Leica | SP5 STED | |
DMEM-high glucose media containing L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
DMEM/F-12 media containing L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 21041025 | |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools Inc | 11252-20 | |
Epidermal growth factor | Merck Millipore | 01-107 | |
Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 16140071 | |
Fluorescent stereo microscope | Leica | M165 FC | |
HEK293T cell line | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
Hydrocortisone | SigmaAldrich | 227035 | |
Horse serum | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
Insulin | SigmaAldrich | I-6634 | |
MCF10A (M1) cell line | Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) | ||
MCF10Aras (M2) cell line | Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) | ||
MDA-MB-231 cell line | American Type Culture Collection | CRM-HTB-26 | |
Manual micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
Micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
Wide-tip Pasteur pipette (0,5-20 ul) | Eppendorf | F276456I | |
pCMV-VSVG plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
PLV-mCherry plasmid | Addgene | 36084 | |
pMDLg-RRE (gag/pol) plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Houben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
Pneumatic picoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
Polybrene | SigmaAldrich | 107689 | |
Prism 4 software | GraphPad Software | ||
pRSV-REV plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
Stereo microscope | Leica | MZ16FA | |
Tg (fli:EGFP) zebrafish strain | Kindly provided by Dr. Ewa Snaar-Jagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands) | ||
Tris-base | SigmaAldrich | 11814273001 | |
Tricaine (3-aminobenzoic acid) | SigmaAldrich | A-5040 | |
Trypsin-EDTA (0.5%) | ThermoFisher Scientific | 15400054 | |
Petri dishes, polystyrene (60 × 15 mm) | SigmaAldrich | P5481-500EA | |
Polystyrene dish with glass bottom | WillCo | GWST-5040 |