Lo stato di salute del polmone si riflette il tipo e il numero di cellule immunitarie che sono presenti nei bronchioli dei polmoni. Descriviamo una tecnica di lavaggio broncoalveolare che consente di isolare e studio delle cellule non aderenti e fattori solubili dal tratto respiratorio inferiore dei topi.
Lavaggio Broncoalveolare (BAL) è una procedura sperimentale che viene utilizzata per esaminare il contenuto cellulare e acellulare del lume polmonare ex vivo per ottenere una visione di uno stato di malattia in corso.
Qui viene descritto un metodo semplice ed efficiente per eseguire BAL sui polmoni murini senza la necessità di strumenti o attrezzature speciali. Il liquido BAL viene isolato mediante l'inserimento di un catetere nella trachea di topi terminalmente anestetizzati, attraverso i quali viene solcata una soluzione salina nei bronchioli. Il fluido instillato viene ritratto dolcemente per massimizzare il recupero del liquido BAL e per ridurre al minimo le forze di taglio. Questa tecnica consente di preservare la vitalità, la funzione e la struttura delle cellule all'interno delle vie aeree e del fluido BAL.
Numerose tecniche possono essere applicate per ottenere una maggiore comprensione dello stato di malattia del polmone. Qui, una tecnica comunemente utilizzata per l'identificazione e l'enumerazione di diversi tipi di cellule immunitarie èdescritto, dove la citometria a flusso è unito con un pannello di selezione di marcatori specifici superficiali cellulari fluorescente. La procedura BAL qui presentata può essere utilizzato anche per analizzare gli agenti infettivi, costituenti del fluido o di particelle inalate all'interno polmoni murini.
Le vie aeree incontrano numerosi insulti, che può portare a infiammazione, patogeno invasione o trasformazione maligna. Le cellule epiteliali che rivestono il lume polmonari costituiscono uno dei principali ostacoli del corpo dei mammiferi. Insieme a macrofagi alveolari, impediscono minacce ambientali da l'ammissione al sistema sistemica attraverso le vie respiratorie. Esempi di tali minacce includono prodotti chimici organici e inorganici, batteri e virus. Analogamente, vaccinazioni specifiche o interventi terapeutici possono essere progettati per indirizzare i polmoni. In tutti questi casi, l'analisi elaborata della risposta evocata è importante capire, intervenire o prevenire processi biologici che avvengono all'interno del sistema respiratorio.
lavaggio broncoalveolare (BAL) è un metodo prezioso per analizzare tali risposte, come i campioni risultanti contengono informazioni importanti sulle risposte infiammatorie, meccanismi immunitari, e la progressione della malattia infettivaChe può verificarsi nelle vie respiratorie polmonari 1 , 2 . Utilizzando BAL, è possibile studiare le cellule infiltranti. Questo contrasta con i polmoni digeriti, che danno una popolazione cellulare più "sporca", con molte cellule morte e appiccicose. BAL viene eseguito introducendo una soluzione salina nei bronchioli terminali e successivamente recuperando questa soluzione. La soluzione recuperata può quindi essere utilizzata per quantificare e analizzare fenotipicamente polmone residente e infiltrare le cellule infiammatorie. Questo metodo è spesso utilizzato per studiare l'afflusso cellulare nei modelli di malattia delle vie aeree, come l'asma, la malattia polmonare cronica ostruttiva (COPD) e modelli di malattie infettive. Oltre alla composizione cellulare, la composizione molecolare delle vie aeree polmonari si riflette anche nel fluido BAL. Per analizzare, si può analizzare l'associazione enzimatica dell'immunosorbente (ELISA), l'immunoblot e l'analisi simultanea di citochine multiple tramite un array di brani di citochineeseguito per valutare la presenza di citochine e chemochine.
BAL è un metodo ben consolidata per studiare l'afflusso di cellule infiammatorie in modelli animali di malattia respiratoria infiammatorie. L'osservazione di un afflusso cellulare alterato (ad esempio, livelli aumentati di linfociti, eosinofili, neutrofili o) può portare a migliori intuizioni malattia e può essere un parametro oggettivo per valutare le prestazioni di un intervento terapeutico.
L'interpretazione accurata e riproducibile di analisi cellulare BAL richiede che il BAL è eseguita correttamente e che il liquido raccolto viene gestita ed elaborata correttamente. Il termine "lavaggio bronchiale" è stato introdotto più di ottanta anni fa da Stitt 3. Nel 1961, Myrvik ottenuta macrofagi alveolari dal liquido di lavaggio dei polmoni coniglio 3. BAL è ormai un metodo comunemente usato per analizzare e monitorare i polmoni nel modello di topo, ma ilRe è ancora nessun rapporto di una procedura standardizzata BAL nella letteratura scientifica 4, 5. Inoltre, ci sono probabilmente come molti modi per eseguire BAL in quanto vi sono laboratori di ricerca che utilizzano la tecnica del 3, 6, 7, 8, 9, 10, 11. E 'importante che i dati ottenuti dal BAL rappresentano l'intero polmone murino, e non solo una parte del polmone. Questo tipo di variabilità complica l'interpretazione e il confronto dei risultati tra diverse prove.
Qui, un procedimento semplice, economico, e riproducibile BAL è descritto che permette la raccolta della frazione cellulare solubile presente nel lume delle vie aeree del mouse. In breve, un catetere viene inserito nella trachea esposto oFa mouse terminalmente anestetizzato. Una siringa è collegata al catetere e viene introdotta nei polmoni una soluzione salina tamponata contenente acido etilendiammina-tetraacetico (EDTA). I lumi del polmone sono campionati con una dolce ripetizione della soluzione salina utilizzando lo stantuffo. La pressione negativa applicata durante questa fase è minima per impedire il crollo delle vie aeree. Dopo la raccolta, il BAL ottenuto dovrebbe essere elaborato ulteriormente per enumerare e identificare le cellule mediante citometria a flusso.
BAL è una tecnica utile per ottenere citologico e informazioni biochimiche in risposta alle infezioni o farmaci. Inizialmente, BAL è stato utilizzato per gestire l'eccessiva produzione di muco nei pazienti umani affetti da tossicità fosgene 3. Al giorno d'oggi, la tecnica è utilizzata negli esseri umani per studiare la patogenesi del polmone, la diagnosi e la gestione terapeutica delle malattie 3, 24. In animali da laboratorio, BAL è comunemente utilizzato per monitorare risposte infiammatorie, meccanismi immunitari e processi malattie infettive che si verificano nelle vie aeree polmonari 1, 2.
Per studiare il modello cellulare infiammatoria in modelli di malattia respiratoria, BAL dovrebbe essere seguito da conta cellulare assoluta e differenziale. Oltre al numero di cella assoluto, i numeri di cella relativi sono interessanti. Ad esempio, i modelli di riparazione e di cancro mostrano very piccolo a nessun BAL aumenta conta delle cellule. In questo modello, la valutazione della composizione cellulare è utile. Utilizzando colorazione della cellula combinata con microscopia ottica, diversi tipi di cellule, come eosinofili, neutrofili, macrofagi e linfociti, possono essere identificati sulla base di morfologia 25, 26, 27, 28, 29, 30. La citometria a flusso può essere utilizzato per valutazioni specifiche, ad esempio per identificare diversi fenotipi cellule T 7, 31. Oltre alla identificazione delle diverse popolazioni cellulari infiltrante, la composizione non cellulare del polmone può essere studiata utilizzando BAL. Metodi come ELISA, immunoblot, matrice citochine perlina, immunoistochimica, e la reazione a catena della polimerasi quantitativa vengono eseguite su BAL determinare citochine, crescitaFattori e altri componenti infiammatori. Per determinare i danni polmonari, i livelli totali di proteine e di lattato deidrogenasi nel fluido BAL possono anche essere misurati 32 , 33 .
Con lo sviluppo di nuovi strumenti diagnostici, la caratterizzazione genomica e proteomica dei componenti BAL sarà possibile nel prossimo futuro. La combinazione di funzionalità computazionali in espansione e tecnologie di espressione genica ad alta velocità consentirà di definire profili specifici di espressione genica per vari stati di malattia. L'esecuzione di queste tecniche sul fluido BAL può fornire modelli di espressione genica e proteica per identificare le molecole importanti coinvolte nelle diverse fasi delle malattie polmonari.
La limitazione principale dei dati ottenuti con il fluido BAL è la mancanza di comparabilità tra i vari studi di ricerca 3 , 9 . C'è un alto grado divariabilità nella tecnica di lavaggio e il successivo trattamento di BAL. Per poter confrontare ogni prova BAL, è necessario uniformare il tipo di liquido di lavaggio che viene instillata, il sito di instillazione, e la frazione che deve essere analizzato per composizione cellulare e non cellulare. Ci sono differenze significative nel numero di frazioni di lavaggio tra diverse prove, variabile da una a 14 volte 34, 35, 36. Questa differenza può avere un impatto sul numero di cellule totali stimate nei polmoni. E 'importante sapere quale frazione BAL contiene la maggior parte delle cellule. Canzone et al. ha mostrato che circa il 70% del numero totale di cellule sono state recuperate in frazione 2:59 22. Tuttavia, altri rapporti hanno suggerito che il secondo lavaggio conteneva più celle rispetto al primo 37, 38 </sup>. Possiamo concludere da questi studi che una lavanda con una sola frazione non rappresenta l'intero polmone, che porta alla errata interpretazione dei risultati.
La composizione noncellular del fluido BAL contiene informazioni preziose sullo stato di salute del polmone 33, 39, 40. Variazioni della diluizione del liquido BAL contribuisce alla differenza nella quantificazione della frazione solubile e, di conseguenza, le differenze nei risultati tra prove. Canzone et al. rispetto delle proteine e lattato deidrogenasi di ogni frazione lavanda e concluso che la prima frazione di lavaggio conteneva due a tre volte più della seconda frazione.
Per recuperare un campione rappresentativo BAL per l'analisi, alcune considerazioni tecniche sono cruciali. Uno di loro è di eseguire una corretta anestesia. E 'molto importante controllare l'arbitro piedelex del mouse per garantire sedazione terminale. Questo è importante non solo per motivi etici, ma anche perché è difficile da posizionare e mantenere il catetere nella posizione corretta se il mouse non è adeguatamente anestetizzato.
Una seconda importante considerazione tecnica è la posizione del catetere nella trachea. Quando il catetere viene inserito troppo in profondità, può danneggiare la struttura del polmone. L'estremità distale del catetere non dovrebbe raggiungere i polmoni durante la procedura di BAL. Il catetere deve essere stabilizzata e legato con un filo di cotone. Se il catetere non è stabilizzato, la soluzione salina iniettata può fluire verso l'alto nella cavità nasale anziché verso il basso nei polmoni. Durante l'iniezione e l'aspirazione della soluzione salina, è importante mantenere il catetere costante.
I dati ottenuti dal BAL devono rappresentare l'intero polmone murino. Pertanto, è importante infondere un adeguato volume di tampone salino (ie3 mL, suddivisi in 3 aliquote di 1 mL ciascuna). Non esiste una relazione lineare tra la resa cellulare e la resa del fluido BAL. È importante raccogliere la soluzione delicatamente mentre si massaggia il torace del topo. Se le forze di taglio sono troppo forti, la vitalità, la funzione e la struttura delle cellule all'interno delle vie aeree e del fluido BAL possono essere compromesse. Se il liquido aspirato non è visibile nella siringa, spostare con attenzione il catetere più o più in alto nella trachea.
Particolare attenzione deve essere rivolta a specifici aspetti dell'elaborazione e dell'analisi BAL. Questo massimizzerà le informazioni conservate dai campioni BAL. Dopo BAL, le cellule sono in un mezzo salino medio povero di nutrienti. È pertanto molto importante elaborare i campioni entro 1 ora dopo il campionamento BAL. Se è necessario uno stoccaggio prolungato, è necessario utilizzare un supporto nutrizionale.
Per preservare la vitalità cellulare, evitare tubi che promuovano l'adesione cellulare alla superficie. Evita centrifugation di sospensioni cellulari a velocità che possono compromettere l'integrità cellulare o per prevenire risospensione uniforme delle cellule BAL recuperati. cellule del liquido contenente BAL devono essere centrifugate a 400 xg e 4 ° C per 7 minuti. È importante tenere presente che sospensioni cellulari devono essere tenuti a 4 ° C durante la lavorazione.
The authors have nothing to disclose.
LVH è un assistente di ricerca presso il Dipartimento di Biologia Molecolare Biomedica dell'Università di Ghent. ERJ è supportato da UniVacFlu, codice di autorizzazione 607690. KR è supportato da EC-FP7 progetto FLUNIVAC.
balanced salt solution | Thermo Fisher Scientific | 14175-129 | |
ethyleendiaminetetra acetic acid | Sigma-Aldrich | E6511 | irritating |
23G x 1 1/4 needle | Henke Sass Wolf | 4710006030 | size: 0,60 x 30 mm |
26G x 1/2 neelde | Henke Sass Wolf | 4710004512 | size: 0,45*12 mm |
plastic tubing | BD medical technology | 427411 | Polyethylene Tubing, I.D 0.58 mm (.023") O.D. .965 mm (0.38") 30.5m (100') |
sodium pentobarbital | Kela NV | 514 | |
phosphate buffered saline | Lonza | BE17-516F | PBS without Ca++ Mg++ or phenol red; sterile filtered |
1ml syringes | Henke Sass Wolf | 5010.200V0 | non pyrogenic and non toxic |
Forceps | Fine Science Tools GmbH | 91197-00 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools GmbH | 91460-11 | |
centrifuge tube 50 ml | TH.Geyer | 7696705 | Free from Rnase/Dnase/endotoxin |
centrifuge tube 15 ml | TH.Geyer | 7696702 | Free from Rnase/Dnase/endotoxin |
microcentrifuge tube 1,5 ml | Sigma-Aldrich | 0030 120.094 | polypropylene |
Microcentrifuge | Sigma-Aldrich | 5415R | |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004030 | |
ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Lonza | 10-548E | sterile filtered |
live/dead -efluor506 | ebioscience | 65-0866-18 | fixable viability dye |
CD11c-PE-cy7 | eBiosciences | 25-0114-81 | |
SiglecF-PE | BD Pharmingen | 552126 | |
MHCII-APCefluor780 | Biolegend | 107628 | |
CD3-PE-cy5 | VWR | 55-0031-U100 | |
CD19-PE-cy5 | eBiosciences | 15-0193-83 | |
CD11b-V450 | BD Pharmingen | 560455 | |
Ly6G-AF700 | Biolegend | 127621 | |
Absolute Counting Beads | Life Technologies Europe B.V. | C36950 | |
anti-CD16/CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
96-well 340 µl storage plate plate | Falcon | 353263 | V-bottom, natural polypropylene |
flow cytometer | BD Biosciences | ||
catheter | BD Biosciences | 393202 |