Der Gesundheitszustand der Lunge spiegelt sich in der Art und Anzahl der Immunzellen, die in den Bronchiolen der Lunge vorhanden sind. Wir beschreiben eine bronchoalveoläre Lavagetechnik, die die Isolierung und Untersuchung von nichtadhärenten Zellen und löslichen Faktoren aus dem unteren Atemtrakt der Mäuse ermöglicht.
Bronchoalveoläre Lavage (BAL) ist ein experimentelles Verfahren, das verwendet wird, um den zellulären und azellulären Gehalt des Lungenlumens ex vivo zu untersuchen, um Einblick in einen laufenden Krankheitszustand zu erhalten.
Hier wird eine einfache und effiziente Methode beschrieben, um BAL auf murine Lungen ohne die Notwendigkeit von speziellen Werkzeugen oder Ausrüstung durchzuführen. BAL-Flüssigkeit wird durch Einsetzen eines Katheters in die Trachea von endlich anästhesierten Mäusen isoliert, durch die eine Salzlösung in die Bronchiolen eingeflößt wird. Die eingefleckte Flüssigkeit wird vorsichtig zurückgezogen, um die BAL-Flüssigkeitsabfrage zu maximieren und die Scherkräfte zu minimieren. Diese Technik ermöglicht die Lebensfähigkeit, Funktion und Struktur der Zellen innerhalb der Atemwege und BAL-Flüssigkeit zu bewahren.
Es können zahlreiche Techniken angewendet werden, um ein weiteres Verständnis des Krankheitszustands der Lunge zu erhalten. Hier ist eine häufig verwendete Technik zur Identifizierung und Aufzählung verschiedener Immunzellenartenbeschrieben, wobei Cytometry mit einer ausgewählten Gruppe von fluoreszierend markierten Zelloberflächenspezifische Marker kombiniert wird fließen. Die BAL hier vorgestellte Verfahren können auch infektiöse Agenzien, flüssigen Bestandteile oder inhalierter Partikel in murine Lungen zu analysieren.
Die Atemwege begegnen zahlreichen Beleidigungen, die zu Entzündungen, Pathogeninvasionen oder bösartigen Transformation führen können. Die Epithelzellen, die das Lungenlumen bilden, bilden eine der Hauptbarrieren des Säugetierkörpers. Zusammen mit alveolaren Makrophagen verhindern sie, dass Umweltbedrohungen über die Atemwege Zugang zum Systemsystem haben. Beispiele für solche Bedrohungen sind organische und anorganische Chemikalien, Bakterien und Viren. Ebenso können spezifische Immunisierungen oder therapeutische Interventionen auf die Lungen ausgelegt werden. In all diesen Fällen ist eine aufwändige Analyse der evozierten Reaktion wichtig, um biologische Prozesse zu verstehen, zu intervenieren oder zu verhindern, die innerhalb des Atmungssystems stattfinden.
Bronchoalveoläre Lavage (BAL) ist eine unschätzbare Methode, um solche Reaktionen zu analysieren, da die resultierenden Proben wichtige Informationen über die entzündlichen Reaktionen, Immunmechanismen und Infektionskrankheitsprogression enthaltenDas kann in den pulmonalen Atemwegen 1 , 2 auftreten. Durch die Verwendung von BAL ist es möglich, die infiltrierenden Zellen zu untersuchen. Das kontrastiert mit verdauten Lungen, die eine "schmutzigere" Zellpopulation mit vielen toten und klebrigen Zellen geben. BAL wird durch Einführen einer Kochsalzlösung in die terminalen Bronchiolen und anschließende Gewinnung dieser Lösung durchgeführt. Die abgerufene Lösung kann dann verwendet werden, um residenten Lungen zu quantifizieren und phänotypisch zu analysieren und infundierende entzündliche Zellen zu infiltrieren. Diese Methode wird häufig angewendet, um zellulären Zustrom in Krankheitsmodellen der Atemwege, wie Asthma, chronisch obstruktive pulmonary Disease (COPD) und Infektionskrankheiten Modelle zu untersuchen. Neben der zellulären Zusammensetzung spiegelt sich auch die molekulare Zusammensetzung der pulmonalen Atemwege in der BAL-Flüssigkeit. Um dies zu analysieren, können Enzym-verbundener Immunosorbent-Assay (ELISA), Immunoblot und die simultane Analyse von mehreren Zytokinen durch ein Cytokin-Perlen-Array seingeführt, um die Anwesenheit von Zytokinen und Chemokinen zu beurteilen.
BAL ist ein gut etabliertes Verfahren den Einstrom von Entzündungszellen bei entzündlichen Atemwegserkrankungen Tiermodellen zu untersuchen. Die Beobachtung eines veränderten zellulären Einstrom (zB erhöhte Konzentrationen von Lymphozyten, Eosinophilen, Neutrophilen oder) kann zu einem besseren Einblick in die Krankheit führen und kann ein objektiver Parameter sein , die Leistung einer therapeutischen Intervention zu bestimmen.
Die genaue und reproduzierbare Interpretation der BAL zellulären Analyse erfordert, dass die BAL korrekt durchgeführt wird, und dass die aufgefangene Flüssigkeit wird richtig gehandhabt und verarbeitet. Der Begriff „Bronchiallavage“ wurde 3 von Stitt vor mehr als achtzig Jahren eingeführt. Im Jahr 1961 erhielt Myrvik Alveolarmakrophagen aus der Lavage von Kaninchenlungen 3. BAL ist jetzt ein häufig verwendetes Verfahren der Lungen im Mausmodell zu analysieren und zu überwachen, noch diere ist noch kein Bericht eines standardisierten BAL Verfahren in der wissenschaftlichen Literatur 4, 5. Darüber hinaus gibt es wahrscheinlich so viele Möglichkeiten , um BAL durchführen , wie es Forschungslabors sind mit der Technik 3, 6, 7, 8, 9, 10, 11. Es ist wichtig, dass die Daten aus der BAL repräsentieren die ganze Mäuselunge erhalten, und nicht nur einen Teil der Lunge. Diese Art der Variabilität erschwert die Interpretation und Vergleich der Ergebnisse der verschiedenen Studien.
Hier wird ein einfaches, kostengünstiges und reproduzierbares BAL Verfahren wird beschrieben, dass die Sammlung der zellulären und löslichen Fraktion, die in dem Atemweg Lumens der Maus ermöglicht. Kurz gesagt, wird ein Katheter in die Trachea freigelegt o platziertFa anästhesierte Maus. Eine Spritze ist mit dem Katheter verbunden, und eine gepufferte Kochsalzlösung, die Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) enthält, wird in die Lungen eingeführt. Das Lungenlumen wird durch sanftes wiederholtes Spülen der Kochsalzlösung unter Verwendung des Kolbens entnommen. Der Unterdruck, der während dieses Schrittes angewendet wird, ist minimal, um den Zusammenbruch der Atemwege zu verhindern. Nach der Sammlung sollte die erhaltene BAL weiter verarbeitet werden, um die Zellen durch Durchflusszytometrie aufzuzählen und zu identifizieren.
BAL ist eine nützliche Technik, um zytologische und biochemische Informationen als Reaktion auf Infektionen oder Medikamente zu erhalten. Zunächst wurde BAL verwendet, um die übermäßige Schleimproduktion bei Patienten mit Phosgen-Toxizität zu bewältigen 3 . Heutzutage wird die Technik bei Menschen verwendet, um die Lungenpathogenese, die Diagnose und die therapeutische Behandlung von Krankheiten zu untersuchen 3 , 24 . In Labortieren wird BAL häufig verwendet, um entzündliche Reaktionen, Immunmechanismen und Infektionskrankheiten, die in den pulmonalen Atemwegen 1 , 2 auftreten, zu überwachen.
Um das entzündliche Zellmuster bei Atemwegserkrankungsmodellen zu untersuchen, sollte dem BAL eine absolute und differenzielle Zellzählung folgen. Neben der absoluten Zellzahl sind auch die relativen Zellzahlen von Interesse. Zum Beispiel zeigen Reparatur- und Krebsmodelle vEry kleine bis gar keine BAL-Zellzahl erhöht. In diesem Modell ist die Beurteilung der zellulären Zusammensetzung nützlich. Durch die Verwendung von Zellfärbung mit Lichtmikroskopie kombiniert, verschiedene Zelltypen, wie Eosinophile, Neutrophile, Makrophagen und Lymphozyten, können basierend auf der Morphologie 25, 26, 27, 28, 29, 30 identifiziert werden. Durchflusszytometrie kann für spezifische Beurteilungen verwendet werden, wie beispielsweise verschiedene T-Zell – Phänotypen zu identifizieren , 7, 31. Neben der Identifizierung der verschiedenen infiltrierenden Zellpopulationen kann die nicht-zelluläre Zusammensetzung in der Lunge untersucht wird BAL verwendet. Verfahren, wie ELISA, Immunoblot, Zytokin-bead array, Immunhistochemie und quantitative Polymerase-Kettenreaktion werden auf BAL-Flüssigkeit durchgeführt, Cytokine, Wachstum um zu bestimmen,Faktoren und anderen entzündlichen Komponenten. Zur Bestimmung der Lungenschädigung können auch die Gesamtprotein- und Laktatdehydrogenase-Werte im BAL-Fluid gemessen werden 32 , 33 .
Mit der Entwicklung neuer Diagnosewerkzeuge wird die genomische und proteomische Charakterisierung von BAL-Komponenten in naher Zukunft möglich sein. Die Kombination von erweiterten Berechnungsfähigkeiten und Hochdurchsatz-Genexpressionstechnologien ermöglicht es, spezifische Genexpressionsprofile für verschiedene Krankheitszustände zu definieren. Die Durchführung dieser Techniken auf BAL-Flüssigkeit kann Gen- und Protein-Expressionsmuster liefern, um die wichtigen Moleküle zu identifizieren, die an den verschiedenen Phasen der Lungenerkrankungen beteiligt sind.
Die Hauptbeschränkung der Daten aus BAL-Flüssigkeit ist die mangelnde Vergleichbarkeit zwischen verschiedenen Forschungsversuchen 3 , 9 . Es gibt ein hohes Maß anVariabilität in der Lavagetechnik und die anschließende Verarbeitung von BAL-Flüssigkeit. Um jede BAL-Studie vergleichen zu können, ist es notwendig, die Art der eingesparten Spülflüssigkeit, die Instillationsstätte und die Fraktion, die für die zelluläre und nicht-zelluläre Zusammensetzung analysiert werden soll, zu standardisieren. Es gibt signifikante Unterschiede in der Anzahl der Spaltfraktionen zwischen verschiedenen Studien, die von einem bis 14 mal 34 , 35 , 36 variieren. Dieser Unterschied kann einen Einfluss auf die geschätzten Gesamtzellzahlen in den Lungen haben. Es ist wichtig zu wissen, welche BAL-Fluidfraktion die Mehrheit der Zellen enthält. Song et al. Zeigte, dass etwa 70% der Gesamtzahl der Zellen in Fraktion eins bis drei 22 abgerufen wurden. Jedoch schlugen andere Berichte vor, dass die zweite Lavage mehr Zellen enthielt als die erste 37 , 38 </sup>. Wir können aus diesen Studien kommen zum Schluss, dass eine Spülung mit nur einem Bruchteil nicht die ganze Lunge darstellen wird, was zu einer Fehlinterpretation der Ergebnisse.
Die nichtzelluläre Zusammensetzung der BAL – Flüssigkeit enthält wertvolle Informationen über den Gesundheitszustand der Lunge 33, 39, 40. Variationen in der Verdünnung der BAL-Flüssigkeit tragen zu der Differenz in der Quantifizierung der löslichen Fraktion und folglich auf den Unterschiede in den Ergebnissen zwischen den Versuchen. Song et al. verglichen, um das Protein und Lactatdehydrogenase Ebene jeder Fraktion Lavage und folgerte, dass die Fraktion erste lavage zwei- bis dreimal mehr als die zweite Fraktion enthielt.
Um eine repräsentative BAL Probe zur Analyse abgerufen werden, sind einige technische Überlegungen von entscheidender Bedeutung. Einer von ihnen ist die richtige anesthetization auszuführen. Es ist sehr wichtig, den Fuß ref zu überprüfenLex der Maus, um die endgültige Sedierung zu gewährleisten. Dies ist nicht nur aus ethischen Gründen wichtig, sondern auch, weil es schwierig ist, den Katheter in der richtigen Position zu platzieren und zu halten, wenn die Maus nicht richtig betäubt wird.
Eine zweite wichtige technische Betrachtung ist die Position des Katheters in der Trachea. Wenn der Katheter zu tief eingelegt ist, kann er die Lungenstruktur beschädigen. Das distale Ende des Katheters sollte während des BAL-Verfahrens nicht in die Lunge gelangen. Der Katheter sollte auch mit einem Baumwollfaden stabilisiert und abgebunden werden. Wenn der Katheter nicht stabilisiert ist, kann die eingespritzte Kochsalzlösung nach oben in die Nasenhöhle fließen, anstatt in die Lunge zu gelangen. Während der Injektion und Absaugung der Kochsalzlösung ist es wichtig, den Katheter stabil zu halten.
Die aus der BAL-Flüssigkeit gewonnenen Daten müssen die gesamte murine Lunge darstellen. Daher ist es wichtig, ein ausreichendes Volumen an Kochsalzlösung Puffer ( dh3 ml, aufgeteilt in 3 Aliquots von jeweils 1 ml). Es gibt keine lineare Beziehung zwischen der Zellausbeute und der BAL-Fluidausbeute. Es ist wichtig, die Lösung sanft zu sammeln, während man den Thorax der Maus massiert. Wenn Scherkräfte zu stark sind, können die Lebensfähigkeit, die Funktion und die Struktur der Zellen innerhalb der Atemwege und der BAL-Flüssigkeit beeinträchtigt werden. Wenn die angesaugte Flüssigkeit in der Spritze nicht sichtbar ist, bewegen Sie den Katheter vorsichtig oder tiefer in die Luftröhre.
Besondere Hinweise auf spezifische Aspekte der BAL-Verarbeitung und -Analyse. Dadurch werden die von BAL-Samples erhaltenen Informationen maximiert. Nach BAL sind die Zellen in einem nährstoffarmen salzhaltigen Medium. Es ist daher sehr wichtig, die Proben innerhalb von 1 h nach der BAL-Probenahme zu verarbeiten. Wenn eine verlängerte Lagerung erforderlich ist, ist die Verwendung eines Nährstoff-ergänzten Mediums erforderlich.
Um die Lebensfähigkeit der Zellen zu bewahren, vermeiden Sie Röhrchen, die die Zelladhäsion an der Oberfläche fördern. Vermeiden Sie centrifugation von Zellsuspensionen bei Geschwindigkeiten, die wahrscheinlich zelluläre Integrität gefährden oder einheitliche Aufwirbelung der abgerufenen BAL-Zellen zu verhindern. BAL-Flüssigkeit enthaltenden Zellen sollten bei 400 xg und 4 ° C für 7 min zentrifugiert werden. Es ist wichtig, im Auge zu behalten, dass die Zellsuspensionen sollen bei 4 ° C während der Verarbeitung gehalten werden.
The authors have nothing to disclose.
LVH ist wissenschaftlicher Mitarbeiter am Institut für Biomedizinische Molekularbiologie der Universität Gent. ERJ wird durch UniVacFlu unterstützt, Gewährungsnummer 607690. KR wird von EC-FP7-Projekt FLUNIVAC unterstützt.
balanced salt solution | Thermo Fisher Scientific | 14175-129 | |
ethyleendiaminetetra acetic acid | Sigma-Aldrich | E6511 | irritating |
23G x 1 1/4 needle | Henke Sass Wolf | 4710006030 | size: 0,60 x 30 mm |
26G x 1/2 neelde | Henke Sass Wolf | 4710004512 | size: 0,45*12 mm |
plastic tubing | BD medical technology | 427411 | Polyethylene Tubing, I.D 0.58 mm (.023") O.D. .965 mm (0.38") 30.5m (100') |
sodium pentobarbital | Kela NV | 514 | |
phosphate buffered saline | Lonza | BE17-516F | PBS without Ca++ Mg++ or phenol red; sterile filtered |
1ml syringes | Henke Sass Wolf | 5010.200V0 | non pyrogenic and non toxic |
Forceps | Fine Science Tools GmbH | 91197-00 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools GmbH | 91460-11 | |
centrifuge tube 50 ml | TH.Geyer | 7696705 | Free from Rnase/Dnase/endotoxin |
centrifuge tube 15 ml | TH.Geyer | 7696702 | Free from Rnase/Dnase/endotoxin |
microcentrifuge tube 1,5 ml | Sigma-Aldrich | 0030 120.094 | polypropylene |
Microcentrifuge | Sigma-Aldrich | 5415R | |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004030 | |
ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Lonza | 10-548E | sterile filtered |
live/dead -efluor506 | ebioscience | 65-0866-18 | fixable viability dye |
CD11c-PE-cy7 | eBiosciences | 25-0114-81 | |
SiglecF-PE | BD Pharmingen | 552126 | |
MHCII-APCefluor780 | Biolegend | 107628 | |
CD3-PE-cy5 | VWR | 55-0031-U100 | |
CD19-PE-cy5 | eBiosciences | 15-0193-83 | |
CD11b-V450 | BD Pharmingen | 560455 | |
Ly6G-AF700 | Biolegend | 127621 | |
Absolute Counting Beads | Life Technologies Europe B.V. | C36950 | |
anti-CD16/CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
96-well 340 µl storage plate plate | Falcon | 353263 | V-bottom, natural polypropylene |
flow cytometer | BD Biosciences | ||
catheter | BD Biosciences | 393202 |