De gezondheidsstatus van de long wordt weerspiegeld door het type en het aantal immuuncellen die aanwezig zijn in de bronchiolen van de long. We beschrijven een bronchoalveolaire lavage techniek die de isolatie en studie van niet-adherente cellen en oplosbare factoren uit het onderste luchtwegen van muizen mogelijk maakt.
Bronchoalveolar Lavage (BAL) is een experimentele procedure die gebruikt wordt om de cel- en acellulaire inhoud van het longlumen ex vivo te onderzoeken om inzicht te krijgen in een lopende ziekte toestand.
Hier wordt een eenvoudige en efficiënte methode beschreven om BAL uit te voeren op muizenlonge zonder speciale gereedschappen of apparatuur. BAL-vloeistof wordt geïsoleerd door een katheter in de luchtpijp van terminale verdoofde muizen in te voeren, waardoor een zoutoplossing in de bronchiolen wordt ingebracht. De ingevoerde vloeistof wordt voorzichtig teruggetrokken om BAL-vloeistofherwinning te maximaliseren en de schuifkrachten te minimaliseren. Deze techniek maakt het mogelijk om de levensvatbaarheid, functie en structuur van cellen in de luchtwegen en BAL-vloeistof te behouden.
Talrijke technieken kunnen worden toegepast om verder inzicht te krijgen in de ziekte van de long. Hier is een veelgebruikte techniek voor het identificeren en opsomming van verschillende soorten immuuncellenBeschreven, waarbij stromingscytometrie gecombineerd wordt met een selectiepaneel van fluorescent gelabelde celoppervlakspecifieke markers. De BAL-procedure die hier wordt gepresenteerd, kan ook gebruikt worden om infectieuze stoffen, vloeibare bestanddelen of ingeasemde deeltjes in muizenlongen te analyseren.
De luchtwegen stuiten op talrijke beledigingen, wat kan leiden tot ontstekingen, pathogeen invasie, of kwaadaardige transformatie. De epitheliale cellen die de long lumen lijn vormen een grote belemmering van het zoogdierlichaam. Samen met alveolaire macrofagen, te voorkomen dat zij bedreigingen voor het milieu van het verkrijgen van toegang tot de systemische systeem via de luchtwegen. Voorbeelden van dergelijke bedreigingen omvatten organische en anorganische chemicaliën, bacteriën en virussen. Op dezelfde manier kunnen specifieke inentingen of therapeutische interventies worden ontworpen om de longen te richten. In al deze gevallen, een uitgebreide analyse van de opgeroepen respons is belangrijk om te begrijpen, grijpen, of biologische processen die plaatsvinden binnen de luchtwegen te voorkomen.
Bronchoalveolaire lavage (BAL) is een waardevolle methode om dergelijke responsen te analyseren, omdat de resulterende monsters belangrijke informaties ontstekingsreacties immuunmechanismen bevatten en besmettelijke ziekteprogressieDat kan optreden in de pulmonale luchtwegen 1 , 2 . Door gebruik te maken van BAL, is het mogelijk om de infiltrerende cellen te bestuderen. Dit contrastt met verteerde longen, die een "vuiler" celpopulatie geven, met veel dode en kleverige cellen. BAL wordt uitgevoerd door een zoutoplossing in de terminale bronchiolen in te voeren en vervolgens deze oplossing te herstellen. De opgehaalde oplossing kan dan gebruikt worden om inwonende long en infiltrerende ontstekingscellen te kwantificeren en fenotypisch te analyseren. Deze methode wordt vaak toegepast voor het bestuderen van cellulaire instroom in ziektebeelden van de luchtwegen, zoals astma, chronische obstructieve longziekte (COPD) en infectieziekte modellen. Afgezien van de cellulaire samenstelling wordt ook de moleculaire samenstelling van de pulmonale luchtwegen weerspiegeld in de BAL vloeistof. Om dit te analyseren kan Enzyme-gekoppelde Immunosorbent Assay (ELISA), immunoblot, en de gelijktijdige analyse van meerdere cytokinen door een cytokine-kraalgroep wordenuitgevoerd om de aanwezigheid van cytokines en chemokines beoordelen.
BAL is een gevestigde methode om de influx van ontstekingscellen onderzoeken bij inflammatoire respiratoire aandoeningen diermodellen. De waarneming van een veranderde cellulaire influx (bijvoorbeeld verhoogde niveaus van lymfocyten, eosinofielen, of neutrofielen) kan leiden tot een beter inzicht in de ziekte en kan een objectieve parameter om de prestaties van een therapeutische interventie te kunnen beoordelen.
De nauwkeurige en reproduceerbare interpretatie van BAL cellulaire analyse vereist dat de BAL juist wordt uitgevoerd en dat de verzamelde vloeistof wordt behandeld en goed verwerkt. De term "bronchiale lavage" werd meer dan tachtig jaar geleden geïntroduceerd door Stitt 3. In 1961 Myrvik verkregen alveolaire macrofagen van de spoelvloeistof konijn longen 3. BAL is nu een veel gebruikte methode voor het analyseren en bewaken van de longen in het muismodel, maar deRe is nog geen rapport van een gestandaardiseerde BAL procedure in de wetenschappelijke literatuur 4 , 5 . Bovendien zijn er waarschijnlijk zoveel manieren om BAL uit te voeren, omdat er onderzoekslaboratoria zijn die de techniek 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 gebruiken. Het is belangrijk dat de gegevens die verkregen worden uit de BAL de hele muizenlong vertegenwoordigen, en niet alleen een deel van de long. Dit soort veranderingen compliceert de interpretatie en vergelijking van resultaten tussen verschillende proeven.
Hier wordt een basale, goedkope en reproduceerbare BAL-procedure beschreven die het mogelijk maakt de verzameling van de cellulaire en oplosbare fractie die aanwezig is in het luchtweglumen van de muis mogelijk te maken. Kortom, een katheter wordt in de blootgestelde luchtpijp geplaatstfa terminaal verdoofde muis. Een injectiespuit wordt verbonden met de katheter, en een gebufferde zoutoplossing die ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) wordt in de longen. De long lumen wordt bemonsterd door voorzichtig herhaaldelijk spoelen van de zoutoplossing met de zuiger. De negatieve druk die tijdens deze stap minimaal luchtwegcollaps voorkomen. Na verzameling dient de verkregen BAL verder verwerkt te noemen en identificeren van de cellen door flowcytometrie.
BAL is een nuttige techniek om cytologische en biochemische informatie te verkrijgen in reactie op infecties of medicijnen. Aanvankelijk werd BAL gebruikt om de overmatige mucusproductie te beheren bij menselijke patiënten die lijden aan fosgeen toxiciteit 3 . Tegenwoordig wordt de techniek gebruikt bij mensen om longpatogenese, diagnose en therapeutisch beheer van ziekten 3 , 24 te onderzoeken. Bij laboratoriumdieren wordt BAL meestal gebruikt om ontstekingsreacties, immuunmechanismen en infectieuze ziekteprocessen te controleren die zich voordoen in de longwegen 1 , 2 .
Om het ontstekingscellulaire patroon in de ademhalingsziekte modellen te bestuderen, moet BAL gevolgd worden door absolute en differentiële celtelling. Naast het absolute celnummer zijn ook de relatieve cijfers van belang. Bijvoorbeeld, reparatie en kankermodellen tonen vEry klein of geen BAL cel telling stijgt. In dit model is de beoordeling van de cellulaire samenstelling bruikbaar. Door celkleuring gecombineerd met lichtmicroscopie te gebruiken, kunnen verschillende celsoorten, zoals eosinofielen, neutrofielen, macrofagen en lymfocyten, worden geïdentificeerd op basis van morfologie 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 . Flowcytometrie kan worden gebruikt voor specifieke evaluaties, zoals het identificeren van verschillende T-cel fenotypes 7 , 31 . Naast de identificatie van de verschillende infiltrerende celpopulaties kan de niet-cellulaire samenstelling van de long onderzocht worden met BAL. Methoden zoals ELISA, immunoblot, cytokine kraalmatrix, immunohistochemie en kwantitatieve polymerase kettingreactie worden uitgevoerd op BAL-vloeistof om cytokinen te bepalen, groeiFactoren en andere ontstekingscomponenten. Om longschade te bepalen, kunnen de totale eiwit- en lactaatdehydrogenase-niveaus in het BAL-vloeistof ook 32 , 33 gemeten worden.
Met de ontwikkeling van nieuwe diagnostische hulpmiddelen zal de genomische en proteomische karakterisering van BAL componenten in de nabije toekomst mogelijk zijn. De combinatie van uitbreiding van de computergestuurdheid en de doordruktechnologieën met hoge doorvoer, maakt het mogelijk specifieke genuitdrukkingsprofielen voor verschillende ziektetoestanden te definiëren. Uitvoering van deze technieken op BAL-vloeistof kan gen- en eiwituitdrukkingspatronen verschaffen om de belangrijke moleculen die betrokken zijn bij de verschillende fasen van longziekten te identificeren.
De belangrijkste beperking van de gegevens verkregen uit BAL-vloeistof is het gebrek aan vergelijkbaarheid tussen verschillende onderzoeksproeven 3 , 9 . Er is een hoge mate vanVariabiliteit in de spoeltechniek en de daaropvolgende verwerking van BAL-vloeistof. Om elk BAL-proef te kunnen vergelijken, is het nodig om het type ingevoerde vloeibare vloeistof, de plaats van instillatie te standaardiseren en de fractie die moet worden geanalyseerd voor cellulaire en niet-cellulaire samenstelling. Er zijn significante verschillen in het aantal lavagefracties tussen verschillende proeven, variërend van 1 tot 14 keer 34 , 35 , 36 . Dit verschil kan invloed hebben op de geschatte totale cijfers in de longen. Het is belangrijk om te weten welke BAL-vloeistoffractie de meerderheid van de cellen bevat. Song et al. Toonde aan dat ongeveer 70% van het totale aantal cellen in fracties 1 tot en met 3 was opgehaald. Andere rapporten hebben echter voorgesteld dat de tweede lavage meer cellen bevat dan de eerste 37 , 38 </sup>. Uit deze studies kunnen we concluderen dat een lavage met slechts een fractie de hele long niet uitmaakt, wat resulteert in een verkeerde interpretatie van de resultaten.
De noncellulaire samenstelling van het BAL-vloeistof bevat waardevolle informatie over de gezondheidsstatus van de long 33 , 39 , 40 . Variaties in de verdunning van het BAL-vloeistof dragen bij aan het verschil in de kwantificering van de oplosbare fractie en bijgevolg tot verschillen in de resultaten tussen proeven. Song et al. Vergeleken het eiwit- en lactaatdehydrogenasevlak van elke lavagefractie en concludeerde dat de eerste lavagefractie twee tot drie keer meer dan de tweede fractie was.
Om een representatief BAL-monster te halen voor analyse, zijn enkele technische overwegingen van cruciaal belang. Een van hen is het uitvoeren van een goede verdoving. Het is heel belangrijk om de voetref te controlerenLex van de muis om de terminale sedatie te waarborgen. Dit is niet alleen belangrijk om ethische redenen, maar ook omdat het moeilijk is om de katheter in de juiste positie te plaatsen en te bewaren als de muis niet goed verdoofd is.
Een tweede belangrijke technische overweging is de positie van de katheter in de luchtpijp. Wanneer de katheter te diep wordt ingebracht, kan het de longstructuur beschadigen. Het distale uiteinde van de katheter moet de longen niet bereiken tijdens de BAL procedure. De katheter moet ook gestabiliseerd worden en met een katoenen draad afgesloten worden. Als de katheter niet gestabiliseerd is, kan de geïnjecteerde zoutoplossing naar boven in de neusholte stromen in plaats van naar de longen. Tijdens injectie en aspiratie van de zoutoplossing is het belangrijk om de katheter vast te houden.
De gegevens verkregen uit het BAL-vloeistof dienen de hele muizen long te vertegenwoordigen. Daarom is het belangrijk om een voldoende volume zoutoplossing buffer ( dwz3 ml, verdeeld in 3 porties van 1 ml elk). Er is geen lineaire relatie tussen de celopbrengst en de BAL-vloeistofopbrengst. Het is belangrijk om de oplossing voorzichtig te verzamelen terwijl u de thorax van de muis masseert. Als de schuifkrachten te sterk zijn, kan de levensvatbaarheid, functie en structuur van cellen in de luchtwegen en BAL-vloeistof worden gecompromitteerd. Als de gevulde vloeistof niet in de spuit is zichtbaar, beweeg de katheter voorzichtig of hoger in de luchtpijp.
Bijzondere kennisgeving moet gegeven worden aan specifieke aspecten van BAL verwerking en analyse. Dit zal de informatie die uit BAL-samples wordt behouden, maximaliseren. Na BAL zijn de cellen in een nutriëntenarm zoutzuurmedium. Het is daarom heel belangrijk om de monsters binnen 1 uur na BAL-monsterneming te verwerken. Indien langdurige opslag nodig is, is het gebruik van een voedingsmiddel aangevuld medium nodig.
Om de levensvatbaarheid van de cel te behouden, vermijd buizen die celadhesie aan het oppervlak bevorderen. Vermijd ceNtrifugatie van cel suspensies bij snelheden die waarschijnlijk de cellulaire integriteit in gevaar brengen of om eenvormige resuspensie van de opgehaalde BAL-cellen te voorkomen. BAL-vloeistof bevattende cellen moeten gedurende 7 minuten bij 400 xg en 4 ° C gecentrifugeerd worden. Het is belangrijk in gedachten te houden dat cel suspensies tijdens de verwerking bij 4 ° C gehouden moeten worden.
The authors have nothing to disclose.
LVH is een onderzoeksassistent aan het Departement Biomedische Moleculaire Biologie van de Universiteit Gent. ERJ wordt ondersteund door UniVacFlu, subsidie nummer 607690. KR wordt ondersteund door EC-FP7 project FLUNIVAC.
balanced salt solution | Thermo Fisher Scientific | 14175-129 | |
ethyleendiaminetetra acetic acid | Sigma-Aldrich | E6511 | irritating |
23G x 1 1/4 needle | Henke Sass Wolf | 4710006030 | size: 0,60 x 30 mm |
26G x 1/2 neelde | Henke Sass Wolf | 4710004512 | size: 0,45*12 mm |
plastic tubing | BD medical technology | 427411 | Polyethylene Tubing, I.D 0.58 mm (.023") O.D. .965 mm (0.38") 30.5m (100') |
sodium pentobarbital | Kela NV | 514 | |
phosphate buffered saline | Lonza | BE17-516F | PBS without Ca++ Mg++ or phenol red; sterile filtered |
1ml syringes | Henke Sass Wolf | 5010.200V0 | non pyrogenic and non toxic |
Forceps | Fine Science Tools GmbH | 91197-00 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools GmbH | 91460-11 | |
centrifuge tube 50 ml | TH.Geyer | 7696705 | Free from Rnase/Dnase/endotoxin |
centrifuge tube 15 ml | TH.Geyer | 7696702 | Free from Rnase/Dnase/endotoxin |
microcentrifuge tube 1,5 ml | Sigma-Aldrich | 0030 120.094 | polypropylene |
Microcentrifuge | Sigma-Aldrich | 5415R | |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004030 | |
ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Lonza | 10-548E | sterile filtered |
live/dead -efluor506 | ebioscience | 65-0866-18 | fixable viability dye |
CD11c-PE-cy7 | eBiosciences | 25-0114-81 | |
SiglecF-PE | BD Pharmingen | 552126 | |
MHCII-APCefluor780 | Biolegend | 107628 | |
CD3-PE-cy5 | VWR | 55-0031-U100 | |
CD19-PE-cy5 | eBiosciences | 15-0193-83 | |
CD11b-V450 | BD Pharmingen | 560455 | |
Ly6G-AF700 | Biolegend | 127621 | |
Absolute Counting Beads | Life Technologies Europe B.V. | C36950 | |
anti-CD16/CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
96-well 340 µl storage plate plate | Falcon | 353263 | V-bottom, natural polypropylene |
flow cytometer | BD Biosciences | ||
catheter | BD Biosciences | 393202 |