وينعكس الوضع الصحي للرئة عن طريق نوع وعدد الخلايا المناعية الموجودة في القصبات الرئوية. نحن تصف تقنية غسل القصبات التي تسمح العزلة ودراسة الخلايا غير متماثلة والعوامل القابلة للذوبان من الجهاز التنفسي السفلي من الفئران.
القصبات القصبي (بال) هو إجراء تجريبي يستخدم لدراسة المحتوى الخلوي والخلوي من التجويف الرئة السابقين الجسم الحي للحصول على نظرة ثاقبة حالة المرض الجارية.
هنا، وصفت طريقة بسيطة وفعالة لأداء بال على الرئتين الفئران دون الحاجة إلى أدوات خاصة أو المعدات. يتم عزل السائل بال عن طريق إدخال قسطرة في القصبة الهوائية من الفئران تخدير انتهائية، من خلالها يتم غرس محلول ملحي في القصيبات. يتم سحب السائل الغرس بلطف لتعظيم استرجاع السوائل بال وتقليل قوى القص. هذه التقنية تسمح بقاء، وظيفة، وهيكل الخلايا داخل الشعب الهوائية والسوائل بال للحفاظ عليها.
ويمكن تطبيق العديد من التقنيات للحصول على مزيد من الفهم لحالة المرض من الرئة. هنا، تقنية شائعة الاستخدام لتحديد وتعداد أنواع مختلفة من الخلايا المناعية هووصفها، حيث التدفق الخلوي وجنبا إلى جنب مع لوحة مختارة من علامات محددة سطح الخلية fluorescently المسمى. ويمكن أيضا إجراء BAL المعروضة هنا أن تستخدم لتحليل العوامل المعدية، مكونات السوائل، أو الجسيمات المستنشقة داخل الرئتين الفئران.
تواجه الشعب الهوائية العديد من الشتائم، والتي يمكن أن تؤدي إلى التهاب، غزو الممرض، أو التحول الخبيث. الخلايا الظهارية التي تشكل خط التجويف الرئة تشكل واحدة من الحواجز الرئيسية للجسم الثدييات. جنبا إلى جنب مع البلاعم السنخية، فإنها تمنع التهديدات البيئية من الدخول إلى النظام النظامي عبر الشعب الهوائية. ومن أمثلة هذه التهديدات المواد الكيميائية العضوية وغير العضوية، والبكتيريا، والفيروسات. وبالمثل، يمكن تصميم التحصينات أو التدخلات العلاجية المحددة لاستهداف الرئتين. في جميع هذه الحالات، تحليل مفصل للاستجابة أثار مهم لفهم، التدخل، أو منع العمليات البيولوجية التي تحدث داخل الجهاز التنفسي.
غسل القصبات (بال) هو وسيلة لا تقدر بثمن لتحليل هذه الردود، حيث أن العينات الناتجة تحتوي على معلومات هامة حول الاستجابات الالتهابية، وآليات المناعة، وتطور الأمراض المعديةالتي يمكن أن تحدث في الشعب الهوائية الرئوية 1 و 2. باستخدام BAL، فمن الممكن لدراسة الخلايا التسلل. وهذا يتناقض مع الرئتين هضمها، التي تعطي "أقذر" سكان الخلية، مع العديد من الخلايا الميتة ولزجة. يتم تنفيذ BAL عن طريق إدخال محلول ملحي في القصيبات الطرفية وبعد ذلك يتعافى هذا الحل. ويمكن بعد ذلك حل استردادها أن تستخدم لتحديد وتحليل ظاهريا الرئة المقيمين وتسلل الخلايا الالتهابية. في كثير من الأحيان يتم تطبيق هذا الأسلوب لدراسة تدفق الخلوي في نماذج المرض في الشعب الهوائية، مثل الربو ومرض الرئة الانسدادي المزمن (COPD)، ونماذج الأمراض المعدية. وبصرف النظر عن تكوين الخلايا، وينعكس التركيب الجزيئي في الشعب الهوائية الرئوية أيضا في السائل BAL. لتحليل هذا، انزيم مرتبط المناعي فحص (ELISA)، مناعية، والتحليل في وقت واحد من السيتوكينات متعددة من قبل مجموعة خلوى حبة يمكن أن يكونأجريت لتقييم وجود السيتوكينات و تشيموكينس.
بال هو طريقة راسخة لدراسة تدفق الخلايا الالتهابية في نماذج التهابات أمراض الجهاز التنفسي الحيوانية. مراقبة تدفق الخلوي تغير (على سبيل المثال، زيادة مستويات الخلايا الليمفاوية، الحمضات، أو العدلات) يمكن أن يؤدي إلى رؤى أفضل في المرض ويمكن أن يكون معلما موضوعيا لتقييم أداء التدخل العلاجي.
يتطلب تفسير دقيقة وقابلة للتكرار للتحليل الخلوي بال أن يتم تنفيذ بال بشكل صحيح وأنه يتم التعامل مع السوائل التي تم جمعها ومعالجتها بشكل صحيح. مصطلح "غسل الشعب الهوائية" قدم أكثر من ثمانين عاما من قبل ستيت 3 . في عام 1961، حصل ميرفيك الضامة السنخية من السائل غسل أرنب الرئتين 3 . بال هو الآن طريقة شائعة الاستخدام لتحليل ورصد الرئتين في نموذج الفأر، ولكنإعادة لا يزال لا يوجد تقرير عن إجراء بال موحدة في الأدب العلمي 4 ، 5 . وعلاوة على ذلك، هناك على الأرجح العديد من الطرق لأداء بال كما أن هناك مختبرات البحوث باستخدام تقنية 3 ، 6 ، 7 ، 8 ، 9 ، 10 ، 11 . من المهم أن البيانات التي تم الحصول عليها من بال تمثل الرئة الفئران كله، وليس فقط جزءا من الرئة. هذا النوع من التباين يعقد تفسير ومقارنة النتائج بين التجارب المختلفة.
هنا، وصفت الإجراء الأساسي وغير مكلفة، وقابلة للتكرار بال الذي يسمح جمع جزء الخلوية وقابل للذوبان الموجودة في تجويف مجرى الهواء من الفأرة. باختصار، يتم وضع قسطرة في القصبة الهوائية المكشوفة oفا تخدير الماوس مؤقتا. يتم توصيل المحاقن إلى القسطرة، ويتم إدخال محلول ملحي مخزنة تحتوي على حمض إيثيلينديامينتيتراسيتيك (إدتا) في الرئتين. يتم أخذ عينات تجويف الرئة عن طريق التنظيف المتكرر اللطيف من محلول ملحي باستخدام المكبس. الضغط السلبي المطبق خلال هذه الخطوة هو الحد الأدنى لمنع انهيار مجرى الهواء. بعد جمع، يجب أن تتم معالجتها بال مزيد من التعداد وتحديد الخلايا عن طريق التدفق الخلوي.
بال هو تقنية مفيدة للحصول على المعلومات الخلوية والبيوكيميائية ردا على العدوى أو المخدرات. في البداية، تم استخدام بال لإدارة إنتاج المخاط المفرط في المرضى الذين يعانون من سمية الفوسجين 3 . في الوقت الحاضر، يتم استخدام هذه التقنية في البشر للتحقيق المرضية الرئة، والتشخيص، والعلاجية من الأمراض 3 ، 24 . في الحيوانات المختبرية، ويشيع استخدام بال لمراقبة الاستجابات الالتهابية، وآليات المناعة، وعمليات الأمراض المعدية التي تحدث في الشعب الهوائية الرئوية 1 ، 2 .
لدراسة النمط الخلوي الالتهابي في نماذج أمراض الجهاز التنفسي، يجب أن يتبع بال من قبل العد المطلق والخلايا التفاضلية. بالإضافة إلى رقم الخلية المطلقة، أرقام الخلايا النسبية هي أيضا ذات أهمية. على سبيل المثال، تظهر نماذج الإصلاح والسرطان vريها الصغيرة ولا BAL زيادة عدد خلايا. في هذا النموذج، وتقييم التكوين الخلوي هو مفيد. باستخدام تلطيخ الخلايا جنبا إلى جنب مع المجهر الضوئي، وأنواع مختلفة من الخلايا، مثل الحمضات، العدلات، الضامة، والخلايا الليمفاوية، ويمكن التعرف على أساس التشكل 25 و 26 و 27 و 28 و 29 و 30. التدفق الخلوي يمكن استخدامها لتقييم محددة، مثل التعرف على مختلف الظواهر T-خلية 7، 31. بالإضافة إلى التعرف على مختلف السكان الخلية التسلل، وتكوين غير الخلوية من الرئة يمكن التحقيق باستخدام BAL. يتم تنفيذ أساليب مثل ELISA، مناعية، مجموعة خلوى حبة، المناعية، والكمي تفاعل البلمرة المتسلسل على BAL السائل لتحديد السيتوكينات والنموعوامل ومكونات التهابات أخرى. لتحديد الضرر الرئة، ومجموع مستويات البروتين ونازعة اكتات في السائل BAL يمكن أيضا قياس 32 و 33.
مع تطور أدوات جديدة للتشخيص، فإن التوصيف الجيني والبروتين من المكونات BAL يكون ممكنا في المستقبل القريب. والجمع بين توسيع قدرات الحسابية والتكنولوجيات التعبير الجيني الإنتاجية العالية تجعل من الممكن تحديد ملامح التعبير الجيني محددة لمختلف الحالات المرضية. ويمكن تنفيذ هذه التقنيات على BAL السائل توفير الجينات والبروتينات أنماط لتحديد جزيئات مهمة المشاركة في مراحل مختلفة من أمراض الرئة.
القيد الرئيسي للبيانات التي تم الحصول عليها من BAL السائل هو عدم وجود مقارنة بين مختلف التجارب البحثية 3 و 9. هناك درجة عالية منالتباين في تقنية غسل والتجهيز اللاحقة من السوائل بال. لتكون قادرة على مقارنة كل محاكمة بال، فمن الضروري لتوحيد نوع السائل غسل التي يتم غرس، وموقع تقطير، والجزء الذي يتم تحليلها لتكوين الخلوية وغير الخلوية. هناك اختلافات كبيرة في عدد الكسور غسل بين التجارب المختلفة، وتتراوح من واحد إلى 14 مرات 34 ، 35 ، 36 . هذا الاختلاف قد يكون له تأثير على إجمالي عدد الخلايا في الرئتين. من المهم أن تعرف أي جزء السوائل بال يحتوي على غالبية الخلايا. سونغ وآخرون. أظهرت أن ما يقرب من 70٪ من إجمالي عدد الخلايا تم استرجاعها في جزء واحد إلى ثلاثة 22 . ومع ذلك، أشارت تقارير أخرى أن الغسل الثاني يحتوي على خلايا أكثر من الخلايا الأولى 37 ، 38 </sup>. يمكننا أن نستنتج من هذه الدراسات أن غسل مع جزء واحد فقط لا يمثل الرئة بأكملها، مما يؤدي إلى سوء تفسير النتائج.
تكوين noncellular من السائل BAL يحتوي على معلومات قيمة عن الحالة الصحية للرئة 33 و 39 و 40. الاختلافات في التخفيف من السوائل BAL تسهم في الاختلاف في تقدير حجم الكسر للذوبان، وبالتالي، إلى الاختلافات في النتائج بين التجارب. أغنية وآخرون. مقارنة البروتين ومستويات اللاكتات نازعة من كل جزء غسيل وخلص إلى أن أول جزء غسيل يرد مرتين إلى ثلاث مرات أكثر من جزء الثاني.
لاسترداد عينة تمثيلية BAL للتحليل، وبعض الاعتبارات التقنية حاسمة. واحد منهم هو لأداء التخدير المناسب. من المهم جدا للتحقق من المرجع القدميكس من الماوس لضمان التخدير الطرفي. هذا ليس مهما فقط لأسباب أخلاقية، ولكن أيضا لأنه من الصعب وضع والاحتفاظ القسطرة في الموضع الصحيح إذا لم يتم تخدير الماوس بشكل صحيح.
وهناك اعتبار الفني الثاني المهم هو موقف القسطرة في القصبة الهوائية. عندما يتم إدخال القسطرة عميق جدا، يمكن أن تلحق الضرر هيكل الرئة. يجب على الطرف البعيد من القسطرة لا تصل إلى الرئتين أثناء إجراء BAL. وينبغي أيضا أن يستقر القسطرة، وتعادل قبالة مع خيط القطن. ولو لم يستقر القسطرة، قد تدفق محلول ملحي حقن صعودا إلى تجويف الأنف بدلا من أسفل إلى الرئتين. خلال الحقن وتطلع محلول ملحي، من المهم عقد القسطرة ثابتة.
البيانات التي تم الحصول عليها من السوائل BAL يجب أن يمثل الرئة الفئران كلها. ولذلك، من المهم أن غرس حجم كاف من العازلة المالحة (أي3 مل، مقسمة إلى 3 aliquots من 1 مل لكل منهما). ليست هناك علاقة خطية بين العائد الخلية والعائد السوائل بال. ومن المهم لجمع الحل بلطف بينما تدليك الصدر من الفأرة. إذا قوى القص قوية جدا، وقدرتها على البقاء، وظيفة، وهيكل الخلايا داخل السائل الهوائية وBAL يجوز المساس بها. إذا كان السائل يستنشق غير مرئي في المحقنة، نقل بعناية القسطرة أعمق أو أعلى في القصبة الهوائية.
وينبغي إيلاء إشعار خاص لجوانب محددة من معالجة BAL والتحليل. وهذا تعظيم المعلومات المدورة من العينات BAL. بعد BAL، كانت الخلايا في المياه المالحة المتوسطة الفقيرة بالمغذيات. ولذا فمن المهم جدا لمعالجة العينات في غضون 1 ساعة بعد أخذ العينات BAL. إذا التخزين لفترات طويلة أمر ضروري، لا بد من استخدام وسيلة تستكمل المواد الغذائية.
للحفاظ على بقاء الخلية، وتجنب الأنابيب التي تعزز التزام الخلية إلى السطح. تجنب مntrifugation من الايقاف الخلية بسرعات التي من المحتمل أن تعرض سلامة الخلوية أو لمنع إعادة تعليق موحد للخلايا BAL استردادها. يجب طرد BAL السائل تحتوي على خلايا في 400 x ج و 4 درجة مئوية لمدة 7 دقائق. من المهم أن نضع في اعتبارنا أن تعليق خلية ينبغي أن تعقد في 4 درجات مئوية أثناء المعالجة.
The authors have nothing to disclose.
لف هو مساعد باحث في قسم البيولوجيا الجزيئية الطبية الحيوية من جامعة غنت. ويدعم إرج من قبل ونيفاكفلو، منحة رقم 607690. ويدعم كر من قبل مشروع إيك-FP7 فلونيفاك.
balanced salt solution | Thermo Fisher Scientific | 14175-129 | |
ethyleendiaminetetra acetic acid | Sigma-Aldrich | E6511 | irritating |
23G x 1 1/4 needle | Henke Sass Wolf | 4710006030 | size: 0,60 x 30 mm |
26G x 1/2 neelde | Henke Sass Wolf | 4710004512 | size: 0,45*12 mm |
plastic tubing | BD medical technology | 427411 | Polyethylene Tubing, I.D 0.58 mm (.023") O.D. .965 mm (0.38") 30.5m (100') |
sodium pentobarbital | Kela NV | 514 | |
phosphate buffered saline | Lonza | BE17-516F | PBS without Ca++ Mg++ or phenol red; sterile filtered |
1ml syringes | Henke Sass Wolf | 5010.200V0 | non pyrogenic and non toxic |
Forceps | Fine Science Tools GmbH | 91197-00 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools GmbH | 91460-11 | |
centrifuge tube 50 ml | TH.Geyer | 7696705 | Free from Rnase/Dnase/endotoxin |
centrifuge tube 15 ml | TH.Geyer | 7696702 | Free from Rnase/Dnase/endotoxin |
microcentrifuge tube 1,5 ml | Sigma-Aldrich | 0030 120.094 | polypropylene |
Microcentrifuge | Sigma-Aldrich | 5415R | |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004030 | |
ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Lonza | 10-548E | sterile filtered |
live/dead -efluor506 | ebioscience | 65-0866-18 | fixable viability dye |
CD11c-PE-cy7 | eBiosciences | 25-0114-81 | |
SiglecF-PE | BD Pharmingen | 552126 | |
MHCII-APCefluor780 | Biolegend | 107628 | |
CD3-PE-cy5 | VWR | 55-0031-U100 | |
CD19-PE-cy5 | eBiosciences | 15-0193-83 | |
CD11b-V450 | BD Pharmingen | 560455 | |
Ly6G-AF700 | Biolegend | 127621 | |
Absolute Counting Beads | Life Technologies Europe B.V. | C36950 | |
anti-CD16/CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
96-well 340 µl storage plate plate | Falcon | 353263 | V-bottom, natural polypropylene |
flow cytometer | BD Biosciences | ||
catheter | BD Biosciences | 393202 |