Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles coupled to antibodies recognizing surface antigens. The captured virions or vesicles were labeled with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated in high magnetic field and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence.
Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of some of the EVs. Both virions and EVs carry proteins of the cells that generated them and are antigenically heterogeneous. In spite of their diversity, both viruses and EVs were characterized predominantly by bulk analysis. Here, we describe an original nanotechnology-based high throughput method that allows the characterization of antigens on individual small particles using regular flow cytometers. Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles (MNPs) coupled to antibodies recognizing one of the surface antigens. The captured virions or vesicles were incubated with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated on magnetic columns from unbound antibodies and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence. This method has wide applications and can be used to characterize the antigenic composition of any viral- and non-viral small particles generated by cells in vivo and in vitro. Here, we provide examples of the usage of this method to evaluate the distribution of host cell markers on individual HIV-1 particles, to study the maturation of individual Dengue virions (DENV), and to investigate extracellular vesicles released into the bloodstream.
Клетки многоклеточных организмов имеют много индивидуальных особенностей, которые могут быть либо уникальным для конкретной ячейки или, по меньшей мере, принадлежат уникальных групп ячеек. Даже культивированный клонированные клетки показывают индивидуальные характеристики, о чем свидетельствует их разнообразной морфологии. Кроме того, индивидуальность клетке находит свое отражение в продуктах она выделяет. В случае вирусной инфекции, вирусные частицы могут нести белки из клеток, полученных их. Например, для ВИЧ многих белков клетки – хозяина встроены в вирусной оболочке и вирусы , которые создаются различными клетками могут нести эти белки вируса 1, 2 или "подписи клетка".
Даже без инфекции, клетки выделяют в окружающую медиа маленьких внеклеточного везикул (EVS). Биогенез этих пузырьков и их структуры во многих случаях напоминают, что вирусов, особенно ретровирусов. В последние годы стало ясно,что электромобили, которые первоначально считались «тромбоцитами пыль» 3, представляют собой важную физиологическую систему межклеточной коммуникации. Вместе с двумя другими системами межклеточной коммуникации, а именно межклеточных контактных взаимодействий и выпустили растворимых молекул, электромобили координате нормальной физиологии и изменяются при различных патологиях 4, 5 в том числе вирусных инфекций 6, 7.
Хотя оба выпустили вирусные частицы и внеклеточной везикулы весьма разнообразны, они характеризуются преимущественно навалочных анализа, в которых потеряли свои индивидуальные особенности. Метод сродни проточной цитометрии, которая фенотипы клеток на основе их различных поверхностных антигенов, необходимо, чтобы охарактеризовать отдельные вирусные и вирусоподобные частицы. К сожалению, электромобили или небольшие вирионы не могут быть проанализированы с помощью стандартных цито потокаметоды метрия, потому что они слишком малы, чтобы генерировать сигнал рассеяния света, на котором большинство цитометры полагаются для запуска. Чтобы обойти это ограничение, флуоресценция срабатывания могут быть применены. Тем не менее, если электромобили или вирионы окрашивали флуоресцентными антителами, трудно отличить их от свободных антител и их агрегатов из-за их подобной флуоресценции и сравнимых размеров.
В последнее время мы разработали на основе нанотехнологий метод с высокой пропускной способностью, что позволяет характеризовать антигенов на отдельных мелких частиц с использованием цитометрах регулярного потока 8, 9. Мы используем MNPS до immunocapture частиц , представляющих интерес, как было описано другими группами для различных областей применения 10, 11, 12, 13; однако, наша новая методика позволяет захвата индивидуального SPECIFIC мишени с последующим фенотипирования этих захваченных частиц с помощью проточной цитометрии с использованием флуоресценции инициирующее, а не рассеяния света, без помех со стороны свободных плавающих антител. Этот метод имеет широкое применение и может быть использовано для характеристики антигенный состав любого viral- и невирусных малой частицы генерируемой клеток в естественных условиях и в пробирке при условии наличия специфических флуоресцирующих антител против поверхностных антигенов. Мы уже применили эту методику для изучения нескольких биологических проблем.
В частности, мы оценивали распределение клеточных маркеров принимающих на отдельных ВИЧ-1 частиц 9, мы исследовали созревание отдельных вирусов Денге (DenV) на основе анализа их поверхностных белков 14 и исследовали EVs выделяется в кровь здоровых добровольцев и больных с острым коронарным синдромом (ОКС). Несмотря на то, основываясь на аналогичном принципе,Применение новой техники потребовало разработки конкретных протоколов, которые описаны ниже.
Обычные цитометры потока остаются основным инструментом для анализа клеток на основе их физико-химических характеристик на индивидуальном уровне 18. Основные принципы проточной цитометрии не были изменены с момента его разработки: клетка, которая проходит через лазерный луч и рассеивает свет представляет собой событие, которое запускает запись флуоресцентного спектров, излучаемых клеток переплете флуоресцентных антител. Более мелкие частицы менее 300 нм , не могут быть обнаружены с помощью бокового разброса цитометра , как они рассеивают больше света под большими углами , при которых наиболее проточный цитометр не собирают свет 18. Техника, описанная здесь, позволяет идентифицировать и анализ нескольких антигенов на многочисленных отдельных вирусов или электромобили с помощью обычных цитометров с флуоресцентной срабатывания.
Критические шаги в протоколе, являются связывание антител к MNPS. Наши эксперименты были perforMed с использованием 15 нм наночастиц оксида железа с карбоновой кислотой в качестве реакционно-способную группу, как описано выше 9. По словам производителя, каждый 15 нм MNP может связываться максимум 20 антител; мы связываем примерно 10 антител на 15-нм МНП. Эта оценка основана на количестве антител до и после связывания и числом шариков / мл, как измерено с помощью наночастицами характеризации и проклейки приборов. В принципе, соединение может привести к агрегации частиц и нежелательно. Для того, чтобы проверить, что агрегация не происходит с нашим протоколом, мы проверили это с наночастицами характеризации и проклейки приборов. Этот прибор измеряет гидродинамический диаметр для частиц, который включает покрытия и антител слоев, а не только ядро 15 нм. Мы обнаружили, что большинство соединенных бусинок расположены на одном пике (средний пик при 64,7 ± 4,2 нм с 90% всех событий ниже 73 ± 7,3 нм). Смешивание Ab-МНП сотрудничестваmplexes с вирионов или электромобили в правильной пропорции важно, чтобы MNPS в концентрации на несколько порядков выше, чем EVs / вирионов. Это очень важно для того, чтобы одиночные электромобили / вирионы анализируются. Избегайте совпадения событий, запустив цитометр при низком расходе. Убедитесь в том, чтобы вызвать приобретение на флуоресценцию и использовать объемные элементы управления для измерения концентрации захваченных лиц.
Тем не менее, MNPS может агрегировать или EVs вирионов поперечным сшиванием или связыванием двух или более вирионов к тому же наночастицами. Чтобы проверить это, тест на агрегацию , как описано на рисунке 4 , должно быть выполнено. Даже индивидуально захваченные вирионы или электромобили могут одновременно войти в лазерный луч потока цитометр. Это приведет к созданию ложной позитивности для двух различных антигенов. Чтобы избежать этого, цитометр потока должен быть установлен, как это описано и препараты должны быть разбавлены. Можно проверить, является ли происходит совпадение с помощью того жеСтратегия, как описано в предыдущем пункте. Кроме того , отсутствие совпадения может быть проверена путем анализа серийных разведений препарата и доказательства того, что число событий линейно уменьшается с разбавлением в то время как средняя интенсивность флуоресценции флуоресцентно витражного антигена остается постоянным во всех разведениях (рисунок 5). Другая проблема заключается в том, что слишком мало вирусов / электромобили могут быть захвачены. Это может быть из-за истинного дефицита вирусов / электромобили, которые несут антигены, через которые они захвачены конкретным MNPS. С другой стороны , эффективность захвата мала по разным причинам (например, неэффективное связывание антител к MNPS, отклонение от соотношения MNPS вирионов / электромобили , разработанные для данного протокола и т.д.). Для того, чтобы избежать последней возможности эффективность захвата должна быть специально оценены. Как правило, эффективность должна быть около 90% , как на рисунке 6.
Различные антитела могут создавать помехи из-застерические друг с другом или с антителами, соединенными с MNPS. Для того, чтобы убедиться, что этого не произошло обратного захвата протокол должен быть проверен (как описано в разделе 7. В кратком изложении, вирионов или электромобили должны быть сначала окрашивают флуоресцентным Абс обнаружения, а затем захвачен Ab-MNP комплексов с последующим отделением от свободных плавающих на Абс магнитные колонки.
Flow virometry имеет значительные преимущества по сравнению с существующими методами анализа антигенного состава вирионов или электромобили. Плановые биохимические методы сообщают об общем присутствии определенных белков в препаратах, но не дают никакой информации о гетерогенности вирионов или электромобили. Это включает в себя immunocapture вирионов или электромобили на больших коммерчески доступных частиц. Такие частицы, как правило, от нескольких микрон в диаметре, и каждый из них может захватить сотни или тысячи вирионов или электромобили. Таким образом, любые последующие средние анализа от свойств вирионов / электромобилизахвачен одной частицей. В противоположность этому, поток virometry использует MNPS 10-15 нм в диаметре и с описанным протоколом по меньшей мере, 90% от событий, представляют собой единую вириона или одного EV.
Основным ограничением является то, что все население вирионов или электромобили в препарате не могут быть проанализированы, но только те, которые будут захвачены. Таким образом, выбор антигена, через который вирионы или электромобили захватываются становится критической. Кроме того, в отличие от потока цитометрии числа различных антигенов (количество флуоресцентными антителами против различных антигенов) ограничена малой поверхности вирионов или электромобили. И, наконец, различные антитела могут стерически мешать снова друг с другом из-за малой поверхности (по сравнению с клетками).
Текущий протокол может быть адаптирован для анализа любого вируса или EV любого происхождения, при условии, что специфические антитела, посредством которых они могут быть захвачены доступны. Анализ антигенов на индивидуального разрешения вирионовы исследователей обратиться к патогенез различных фракций вирусных популяций. Кроме того, идентификация отдельных электромобили в плазме может сделать возможным проследить происхождение электромобили к конкретным клеткам и сообщать о нормальных или патологических состояниях этих клеток и органов, в которых они проживают.
The authors have nothing to disclose.
This work of AA, SZ, WF, J-C.G, and LM was supported by the NICHD Intramural Program. The work of MV was supported by the Russian Federation Government grant #14.B25.31.0016.
Materials | |||
Carboxyl Magnetic Iron Oxide Nanoparticles Conjugation Kits | Ocean Nanotech | ICK-15-005 | |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | Millipore | UFC810024 | |
5mL Round Bottom PP Test Tube, without Cap | Falcon | 352002 | |
DEPC treated water | Quality Biological | 351-068-131 | |
SuperMAG-01 magnetic separator | Ocean Nanotech | SuperMAG-01 | |
Zenon R-Phycoerythrin Mouse IgG1 Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | Z25055 | |
Nanosep Centrifugal Devices with Omega Membrane 100k | Pall Corp | OD100C34 | |
EDTA 0.5M | Corning Cellgro | 46-034-CI | |
Bovine Serum Albumin solution | Sigma-Aldrich | A9576-50ML | |
PBS | Gibco | 10010-23 | |
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified | EMS | 15710 | |
123count eBeads | eBioscience | 01-1234-42 | |
CytoCount beads | Dako | S2366 | |
AccuCheck count beads | Invitrogen | PCB100 | |
Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (CST) | BD Bioscience | 642412 | |
Vybrant DiI Cell-Labeling Solution | Thermo Fisher Scientific | V22885 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
µMACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-701 | |
OctoMACS Separator magnet | Miltenyi Biotec | 130-042-108 | |
Nanodrop | ThermoFisher | none | |
NanoSight NS300 | Malvern | none | |
BD LSRII flow cytometer | BD Bioscience | none | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Flowjo software | Flowjo | ||
BD FACSDiva software | BD |