Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles coupled to antibodies recognizing surface antigens. The captured virions or vesicles were labeled with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated in high magnetic field and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence.
Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of some of the EVs. Both virions and EVs carry proteins of the cells that generated them and are antigenically heterogeneous. In spite of their diversity, both viruses and EVs were characterized predominantly by bulk analysis. Here, we describe an original nanotechnology-based high throughput method that allows the characterization of antigens on individual small particles using regular flow cytometers. Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles (MNPs) coupled to antibodies recognizing one of the surface antigens. The captured virions or vesicles were incubated with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated on magnetic columns from unbound antibodies and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence. This method has wide applications and can be used to characterize the antigenic composition of any viral- and non-viral small particles generated by cells in vivo and in vitro. Here, we provide examples of the usage of this method to evaluate the distribution of host cell markers on individual HIV-1 particles, to study the maturation of individual Dengue virions (DENV), and to investigate extracellular vesicles released into the bloodstream.
Le cellule in organismi multicellulari hanno molte caratteristiche individuali che possono essere sia unica per una particolare cella o almeno appartenere a gruppi unici di cellule. Anche le cellule clonate in coltura mostrano caratteristiche individuali come dimostra la loro diversa morfologia. Inoltre, l'individualità di una cellula si riflette nei prodotti che secerne. Nel caso di infezione virale, le particelle virali possono trasportare proteine dalle cellule che li hanno prodotti. Ad esempio, per l'HIV molte proteine della cellula ospite sono incorporati nella busta virale e virus che vengono generati dalle cellule differenti possono portare queste proteine caratteristici 1, 2 o "firme cellulari".
Anche senza l'infezione, le cellule rilasciano nei media che circondano piccole vescicole extracellulari (SVE). Biogenesis di queste vescicole e la loro struttura, in molti casi assomiglia a quella del virus, specialmente retrovirus. Negli ultimi anni è diventato chiaroche i veicoli elettrici, che sono stati inizialmente considerati "polvere di piastrine" 3, costituiscono un importante sistema fisiologico di comunicazione cellula-cellula. Insieme ad altri due sistemi di comunicazione intercellulare, cioè le interazioni di contatto cellula-cellula e molecole solubili rilasciati, i veicoli elettrici coordinare la fisiologia normale e sono alterati in varie patologie 4, 5 tra cui le infezioni virali 6, 7.
Anche se entrambe le particelle virali rilasciate e vescicole extracellulari sono molto diverse, sono caratterizzati prevalentemente da analisi di massa, in cui si perdono le loro caratteristiche individuali. Un metodo simile a citometria a flusso, che fenotipi le cellule in base alle loro differenti antigeni di superficie, è necessaria per caratterizzare le singole particelle virali e virus-like. Purtroppo, i veicoli elettrici o piccole virioni non possono essere analizzati utilizzando cito flusso standardMetodi metria perché sono troppo piccoli per generare il segnale di luce-dispersione in cui la maggior parte citometri contano per l'attivazione. Per aggirare questa limitazione, innescando la fluorescenza può essere applicata. Tuttavia, se EVs o virioni sono colorate con anticorpi fluorescenti è difficile distinguerli da anticorpi liberi e loro aggregati a causa della loro fluorescenza simile e dimensioni paragonabili.
Recentemente, è stato sviluppato un metodo di throughput elevato nanotecnologia-based che permette la caratterizzazione degli antigeni sulle singole particelle di piccole dimensioni che utilizzano regolare flusso citometri 8, 9. Impieghiamo MNPs a particelle immunocapture di interesse, come è stato descritto da altri gruppi per diverse applicazioni 10, 11, 12, 13; tuttavia, la nostra nuova tecnica permette la cattura di speci individualeobiettivi FIC seguiti da fenotipizzazione di queste particelle catturate mediante citometria di flusso utilizzando la fluorescenza innescando invece di dispersione della luce, senza interferenze da parte degli anticorpi che galleggiano liberi. Questo metodo ha applicazioni larghe e può essere utilizzato per caratterizzare la composizione antigenica di qualsiasi piccola particella viral- e non virali generati dalle cellule in vivo e in vitro fornito la disponibilità di anticorpi fluorescenti specifici contro antigeni di superficie. Abbiamo già applicato questa tecnica per studiare diversi problemi biologici.
In particolare, abbiamo valutato la distribuzione dei marcatori di cellule ospitanti sui singoli HIV-1 particelle 9, abbiamo studiato la maturazione dei singoli virus Dengue (DENV) sulla base di analisi delle loro proteine di superficie 14 e studiato EV rilasciati nel flusso sanguigno di volontari sani e pazienti con sindrome coronarica acuta (ACS). Sebbene basato su un principio simile, laapplicazione della nuova tecnica richiesto lo sviluppo di protocolli specifiche descritte di seguito.
Citometri a flusso convenzionali restano il principale strumento per l'analisi delle celle in base alle loro caratteristiche fisiche e chimiche a livello individuale 18. I principi fondamentali della citometria a flusso non sono state modificate dal suo sviluppo: una cellula che passa attraverso il fascio laser e diffonde la luce costituisce un evento che attiva la registrazione degli spettri fluorescente emessa da anticorpi fluorescenti legati alle cellule. Le particelle più piccole inferiori a 300 nm non possono essere rilevati dalla dispersione lato di un citometro come si disperdono più luce in angoli più grandi in cui la maggior parte citofluorimetro non raccolgono la luce 18. La tecnica qui descritta, consente l'identificazione e l'analisi di antigeni multipli su numerosi virus o EVs singoli da citometri a flusso convenzionali con fluorescenza innesco.
Le fasi critiche all'interno del protocollo sono l'accoppiamento di anticorpi MNPs. I nostri esperimenti sono stati performed utilizzando 15 nanoparticelle di ossido di ferro nm con acido carbossilico come gruppo reattivo come descritto in precedenza 9. Secondo il produttore, ogni 15 nm MNP può associare un massimo di 20 anticorpi; leghiamo a circa 10 anticorpi a 15 nm MNP. Questa stima è basata sulla quantità di anticorpi prima e dopo l'accoppiamento ed il numero di perline / mL misurati mediante caratterizzazione delle nanoparticelle e strumentazione dimensionamento. In linea di principio, l'accoppiamento può causare aggregazione delle particelle ed è indesiderabile. Per verificare che l'aggregazione non sta accadendo con il nostro protocollo, abbiamo verificato questo con la caratterizzazione di nanoparticelle e strumentazione dimensionamento. Questo strumento misura il diametro idrodinamico per le particelle, che comprende i coating e anticorpi strati piuttosto che il nucleo 15 nm soltanto. Abbiamo trovato che la maggior parte delle perline accoppiate si trovano in un unico picco (media picco a 64,7 ± 4,2 nm con il 90% di tutti gli eventi al di sotto 73 ± 7.3 nm). La miscelazione di Ab-MNP complexes con virioni o EVs nella giusta proporzione è importante affinché MNPs sono nella concentrazione di diversi ordini superiori EV / virioni. Questo è fondamentale per garantire che i singoli veicoli elettrici / virioni vengono analizzati. Evitare coincidenze degli eventi eseguendo citometro a basso flusso. Assicurarsi di attivare l'acquisizione da fluorescenza e utilizzare i controlli volumetrici per misurare la concentrazione delle entità catturate.
Tuttavia, MNPs può aggregare EVs o virioni per reticolazione o dal legame di due o più virioni alla stessa nanoparticelle. A questo scopo, un test di aggregazione descritto nella figura 4 deve essere eseguita. virioni o EV Anche catturati singolarmente possono simultaneamente accedere al raggio laser del citofluorimetro. Ciò creerebbe falsa positività per due antigeni diversi. Per evitare questo, il citometro di flusso deve essere impostato come descritto e le preparazioni deve essere diluito. Si può verificare se un caso che sta accadendo utilizzando lo stessostrategia come descritto al punto precedente. Inoltre, la mancanza di coincidenza potrebbe essere verificata analizzando diluizioni seriali del preparato e dimostrando che il numero di eventi diminuisce linearmente con la diluizione, mentre l'intensità di fluorescenza media di un antigene fluorescente macchiato rimane costante in tutte le diluizioni (Figura 5). Un altro problema è che troppo pochi i virus / EV può essere catturato. Questo può essere dovuto al vero scarsità di virus / veicoli elettrici che trasportano gli antigeni attraverso i quali vengono catturati da specifici MNPs. In alternativa, l'efficienza di cattura è bassa a causa di vari motivi (ad esempio, l'accoppiamento inefficiente di anticorpi MNPs, deviazione dai rapporti di MNPs a virioni / EVs sviluppati per questo protocollo, ecc). Per evitare quest'ultima possibilità, l'efficienza di cattura deve essere specificamente valutata. Tipicamente, l'efficienza dovrebbe essere di circa il 90% come in Figura 6.
Diversi anticorpi possono interferire a causa disterico tra di loro o con gli anticorpi accoppiati a MNPs. Per verificare che questo non è accaduto un protocollo di acquisizione inversa deve essere testato (come descritto nella sezione 7. In breve, virioni o veicoli elettrici dovrebbero essere prima colorati con fluorescenza Abs rilevazione e poi catturato dai complessi Ab-MNP con successiva separazione da Abs galleggianti gratis colonne magnetiche.
virometry flusso ha vantaggi significativi rispetto ai metodi esistenti di analisi della composizione antigenica dei virioni o veicoli elettrici. metodi biochimici di routine rapporto sulla presenza generale di particolari proteine nelle preparazioni, ma non forniscono informazioni sulla eterogeneità dei virioni o veicoli elettrici. Questo include immunocattura di virioni o veicoli elettrici su particelle di grandi dimensioni disponibili in commercio. Tali particelle sono tipicamente di alcuni micron di diametro e ciascuno di essi può catturare centinaia o migliaia di virioni o EVs. Pertanto, eventuali medie analisi successive le proprietà dei virioni / EVcatturato da una particella. Al contrario, virometry flusso utilizza MNPs di 10-15 nm di diametro e con il protocollo descritto almeno il 90% degli eventi rappresentare un singolo virione o singola EV.
La limitazione principale è che l'intera popolazione di virioni o veicoli elettrici nella preparazione potrebbe non essere analizzato, ma solo quelli che vengono catturati. Così, la scelta dell'antigene attraverso cui vengono acquisite virioni o EVs diventa critica. Inoltre, a differenza di flusso citometria il numero di antigeni diversi (il numero di anticorpi fluorescenti contro diversi antigeni) è limitata dalla piccola superficie di virioni o EVs. Infine, diversi anticorpi possono stericamente interferire tra loro ancora a causa della piccola superficie (rispetto alle cellule).
L'attuale protocollo può essere adattato per l'analisi di qualsiasi virus o EV di qualsiasi origine, a condizione che gli anticorpi specifici attraverso cui possono essere catturati sono disponibili. Analisi di antigeni sulla virioni individuale permessoricercatori s per affrontare la patogenesi di diverse frazioni di popolazioni virali. Inoltre, l'identificazione dei singoli veicoli elettrici nel plasma può consentire di risalire all'origine dei veicoli elettrici a particolari cellule e di riferire sulle condizioni normali o patologiche di queste cellule e gli organi in cui risiedono.
The authors have nothing to disclose.
This work of AA, SZ, WF, J-C.G, and LM was supported by the NICHD Intramural Program. The work of MV was supported by the Russian Federation Government grant #14.B25.31.0016.
Materials | |||
Carboxyl Magnetic Iron Oxide Nanoparticles Conjugation Kits | Ocean Nanotech | ICK-15-005 | |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | Millipore | UFC810024 | |
5mL Round Bottom PP Test Tube, without Cap | Falcon | 352002 | |
DEPC treated water | Quality Biological | 351-068-131 | |
SuperMAG-01 magnetic separator | Ocean Nanotech | SuperMAG-01 | |
Zenon R-Phycoerythrin Mouse IgG1 Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | Z25055 | |
Nanosep Centrifugal Devices with Omega Membrane 100k | Pall Corp | OD100C34 | |
EDTA 0.5M | Corning Cellgro | 46-034-CI | |
Bovine Serum Albumin solution | Sigma-Aldrich | A9576-50ML | |
PBS | Gibco | 10010-23 | |
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified | EMS | 15710 | |
123count eBeads | eBioscience | 01-1234-42 | |
CytoCount beads | Dako | S2366 | |
AccuCheck count beads | Invitrogen | PCB100 | |
Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (CST) | BD Bioscience | 642412 | |
Vybrant DiI Cell-Labeling Solution | Thermo Fisher Scientific | V22885 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
µMACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-701 | |
OctoMACS Separator magnet | Miltenyi Biotec | 130-042-108 | |
Nanodrop | ThermoFisher | none | |
NanoSight NS300 | Malvern | none | |
BD LSRII flow cytometer | BD Bioscience | none | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Flowjo software | Flowjo | ||
BD FACSDiva software | BD |