Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles coupled to antibodies recognizing surface antigens. The captured virions or vesicles were labeled with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated in high magnetic field and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence.
Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of some of the EVs. Both virions and EVs carry proteins of the cells that generated them and are antigenically heterogeneous. In spite of their diversity, both viruses and EVs were characterized predominantly by bulk analysis. Here, we describe an original nanotechnology-based high throughput method that allows the characterization of antigens on individual small particles using regular flow cytometers. Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles (MNPs) coupled to antibodies recognizing one of the surface antigens. The captured virions or vesicles were incubated with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated on magnetic columns from unbound antibodies and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence. This method has wide applications and can be used to characterize the antigenic composition of any viral- and non-viral small particles generated by cells in vivo and in vitro. Here, we provide examples of the usage of this method to evaluate the distribution of host cell markers on individual HIV-1 particles, to study the maturation of individual Dengue virions (DENV), and to investigate extracellular vesicles released into the bloodstream.
الخلايا في الكائنات الحية متعددة الخلايا لديها العديد من الميزات الفردية التي قد تكون إما فريدة من نوعها لخلية معينة أو على الأقل ينتمون إلى مجموعة فريدة من الخلايا. حتى الخلايا المستنسخة مثقف تظهر الخصائص الفردية كما يتضح من التشكل متنوعة. أيضا، وينعكس الفردية خلية في المنتجات التي تفرز. في حالة التهاب فيروسي، يمكن أن الجسيمات الفيروسية تحمل البروتينات من الخلايا التي تنتج منها. على سبيل المثال، لفيروس نقص المناعة البشرية هي جزء لا يتجزأ العديد من البروتينات الخلية المضيفة في المغلف الفيروسية والفيروسات التي يتم إنشاؤها من قبل خلايا مختلفة قد تحمل هذه البروتينات المميزة 1 أو 2 أو "التوقيعات خلية".
حتى من دون العدوى، تطلق الخلايا في وسائل الإعلام المحيطة بها الحويصلات خارج الخلية الصغيرة (السيارات الكهربائية). نشوء حيوي من هذه الحويصلات وبنيتها في كثير من الحالات أن تشبه الفيروسات، وخاصة الفيروسات القهقرية. في السنوات الأخيرة أصبح واضحاأن المركبات الكهربائية، والتي كانت تعتبر في البداية أن يكون "الغبار الصفائح الدموية" 3، تشكل نظام الفسيولوجية المهم التواصل خلية خلية. جنبا إلى جنب مع اثنين من الأنظمة الأخرى من الاتصالات بين الخلايا، وهي التفاعلات خلية خلية الاتصال والجزيئات القابلة للذوبان صدر، المركبات الكهربائية تنسق علم وظائف الأعضاء الطبيعي وغيرت في مختلف الأمراض 4 و 5 منها الالتهابات الفيروسية 6 و 7.
على الرغم من أن كل من الجسيمات الفيروسية صدر والحويصلات خارج الخلية متنوعة للغاية، وتتميز أنها في الغالب عن طريق تحليل بالجملة في التي فقدت خصائصها الفردية. وهناك طريقة أقرب إلى التدفق الخلوي، التي الظواهر الخلايا استنادا المستضدات السطحية المختلفة، وهناك حاجة لتوصيف الجسيمات الفيروسية ومثل الفيروسية الفردية. للأسف، المركبات الكهربائية أو virions الصغيرة لا يمكن تحليلها باستخدام خلوي تدفق قياسيأساليب التناظر لأنها صغيرة جدا لتوليد إشارة تشتت الضوء الذي معظم cytometers تعتمد لتحريك. للتحايل على هذا القيد، يمكن تطبيق مضان اثار. ومع ذلك، إذا هي ملطخة المركبات الكهربائية أو virions مع الأجسام المضادة الفلورسنت فمن الصعب تمييزها عن الأجسام المضادة حرة والمجاميع الخاصة بهم بسبب مضان بهم مماثلة والأحجام المماثلة.
مؤخرا، قمنا بتطوير طريقة الإنتاجية العالية القائم على تكنولوجيا النانو التي تسمح للتوصيف مستضدات على جزيئات صغيرة الفردية باستخدام أجهزة قياس التدفق الخلوي العادي 8، 9. نحن نوظف MNPs إلى جزيئات immunocapture المصالح، كما وصفت من قبل جماعات أخرى لتطبيقات متنوعة 10، 11، 12، 13؛ ومع ذلك، لدينا تقنية جديدة تسمح للقبض على SPECI الفرديةأهداف المرورية تليها phenotyping من هذه الجسيمات التي استولت عليها التدفق الخلوي باستخدام مضان اثار بدلا من تشتت الضوء، دون تدخل من الأجسام المضادة التعويم الحر. هذا الأسلوب له تطبيقات واسعة، ويمكن استخدامها لتوصيف التركيب الأنتيجين من أي الجسيمات الصغيرة viral- وغير الفيروسية التي تولدها الخلايا في الجسم الحي، وقدم في المختبر توافر الأجسام المضادة الفلورسنت محددة ضد المستضدات السطحية. نحن بالفعل بتطبيق هذه التقنية لدراسة العديد من المشاكل البيولوجية.
على وجه الخصوص، قمنا بتقييم توزيع علامات الخلية المضيفة على الفردية HIV-1 الجسيمات 9، درسنا نضوج فيروسات حمى الضنك الفردية (DENV) بناء على تحليل البروتينات سطحها 14 والتحقيق المركبات الكهربائية التي تطلق في مجرى الدم من المتطوعين الأصحاء والمرضى مع متلازمة الشريان التاجي الحادة (ACS). على الرغم من أن تقوم على مبدأ مماثل، فيتطبيق تقنية جديدة تتطلب وضع بروتوكولات محددة الموضحة أدناه.
لا تزال أجهزة قياس التدفق الخلوي التقليدية الأداة الرئيسية لتحليل الخلايا على أساس الخصائص الفيزيائية والكيميائية على المستوى الفردي 18. المبادئ الأساسية للالتدفق الخلوي لم تتغير منذ تطوره: خلية التي يمر شعاع الليزر وينثر الضوء تشكل حدثا الذي يقوم بتشغيل تسجيل أطياف الفلورية المنبعثة من الأجسام المضادة الفلورسنت محددة الخلية. جسيمات أصغر أقل من 300 نانومتر لا يمكن الكشف عن مبعثر الجانب من الكريات كما مبعثر مزيد من الضوء تحت زوايا أكبر في أي أكثر تدفق الكريات لا نجمع ضوء 18. تقنية الموضحة هنا، يسمح بتحديد وتحليل مستضدات متعددة على العديد من الفيروسات الفردية أو المركبات الكهربائية عن طريق أجهزة قياس التدفق الخلوي التقليدية مع مضان اثار.
الخطوات الحاسمة في البروتوكول هي اقتران الأجسام المضادة لMNPs. وادائها تجاربناميد باستخدام 15 جزيئات أكسيد الحديد نانومتر مع حمض الكربوكسيلية كمجموعة رد الفعل كما هو موضح سابقا 9. وفقا لالصانع، يمكن لكل 15 نانومتر حركة الأشخاص الطبيعيين ربط بحد أقصى 20 الأجسام المضادة. نحن ربط حوالي 10 الأجسام المضادة في 15 نانومتر حركة الأشخاص الطبيعيين. ويستند هذا التقدير على كمية من الأجسام المضادة قبل وبعد اقتران وعدد من حبات / مل مقاسا توصيف جسيمات متناهية الصغر والتحجيم الأجهزة. من حيث المبدأ، قد يتسبب اقتران تجميع الجسيمات وغير مرغوب فيها. للتأكد من أن التجميع لا يحدث مع بروتوكول لدينا، ونحن التحقق من ذلك مع توصيف جسيمات متناهية الصغر والتحجيم الأجهزة. يقيس هذا الصك قطر الهيدروديناميكية للجسيمات، والتي تشمل طلاء والأجسام المضادة طبقات بدلا من جوهر 15 نانومتر فقط. لقد وجدنا أن الغالبية العظمى من الخرز يقترن تقع في ذروة واحدة (يعني ذروة 64.7 ± 4.2 نانومتر مع 90٪ من جميع الأحداث دون 73 ± 7.3 نانومتر). اختلاط أب-MNP التعاونmplexes مع virions أو المركبات الكهربائية في نسبة الصحيح من الأهمية بمكان بحيث MNPs هي في تركيز عدة أوامر أعلى من المركبات الكهربائية / virions. هذا أمر بالغ الأهمية لضمان أن المركبات الكهربائية واحدة / ويتم تحليل virions. تجنب الصدف للأحداث عن طريق تشغيل عداد الكريات في التدفق المنخفض. ضمان لتحريك عملية الاستحواذ على مضان واستخدام عناصر التحكم الحجمي لقياس تركيز الكيانات التي تم التقاطها.
ومع ذلك، يمكن MNPs تجميع المركبات الكهربائية أو virions من يشابك أو عن طريق الربط بين اثنين أو أكثر virions لنفس جسيمات متناهية الصغر. للتأكد من ذلك، وهو اختبار لتجميع كما هو موضح في الشكل (4) لابد من القيام بها. virions أو المركبات الكهربائية حتى القبض على حدة قد تدخل في وقت واحد شعاع الليزر لقياس التدفق الخلوي. وهذا من شأنه خلق كاذبة الإيجابية لمدة مستضدات مختلفة. لتجنب هذا، يجب تعيين عداد الكريات تدفق كما هو موضح ويجب تخفيفه التحضيرات. يمكن للمرء أن تحقق ما إذا كان من قبيل المصادفة يحدث باستخدام نفساستراتيجية كما هو موضح في النقطة السابقة. أيضا، لعدم وجود صدفة يمكن التحقق من خلال تحليل التخفيفات المسلسل من إعداد وتثبت أن عدد الأحداث يقلل خطيا مع التخفيف في حين تبقى كثافة مضان يعني وجود مستضد الملون fluorescently ثابتة في جميع التخفيفات (الشكل 5). وثمة مسألة أخرى هي أن عدد قليل جدا من الفيروسات / المركبات الكهربائية يمكن التقاط. هذا يمكن أن يكون بسبب ندرة حقيقية من الفيروسات / المركبات الكهربائية التي تحمل مستضدات التي يتم من خلالها القبض عليهم من قبل MNPs محددة. بدلا من ذلك، وكفاءة التقاط منخفضة لأسباب مختلفة (على سبيل المثال، واقتران فعالة من الأجسام المضادة لMNPs، الانحراف عن نسب MNPs إلى virions / المركبات الكهربائية وضعت لهذا البروتوكول، وما إلى ذلك). لتجنب احتمال الأخيرة، وكفاءة التقاط ينبغي تقييم على وجه التحديد. عادة، يجب أن تكون الكفاءة حوالي 90٪ كما في الشكل (6).
يمكن أن الأجسام المضادة المختلفة تتداخل نظرا لالإعاقة الفراغية مع بعضها البعض أو مع الأجسام المضادة بالإضافة إلى MNPs. للتأكد من أن هذا لم يحدث يجب أن يتم اختبار بروتوكول القبض العكسي (كما هو موضح في القسم 7. فترة وجيزة، virions أو المركبات الكهربائية يجب أن تكون ملطخة أولا مع عبس الكشف الفلوري ومن ثم استولت عليها المجمعات أب-MNP مع فصل لاحق من عبس التعويم الحر على أعمدة المغناطيسية.
تدفق virometry له مزايا كبيرة فيما يتعلق بأساليب القائمة من تحليل تركيبة الأنتيجين من virions أو المركبات الكهربائية. وتفيد وسائل البيوكيميائية الروتينية على وجود العام للبروتينات معينة في التحضير، ولكن توفر أي معلومات عن عدم تجانس virions أو المركبات الكهربائية. وهذا يشمل immunocapture من virions أو المركبات الكهربائية على الجزيئات الكبيرة المتاحة تجاريا. هذه الجسيمات هي عادة من عدة ميكرون في القطر، ولكل واحد منهم يمكن التقاط مئات أو آلاف من virions أو المركبات الكهربائية. ولذلك، فإن أي المتوسطات تحليل لاحقة خصائص virions / المركبات الكهربائيةاستولت عليها جسيم واحد. في المقابل، يستخدم تدفق virometry MNPs من 10-15 نانومتر في القطر ومع بروتوكول صفها لا يقل عن 90٪ من الأحداث تمثل الفيريون واحد أو EV واحد.
القيد الرئيسي هو أن سكان virions أو المركبات الكهربائية في إعداد قد لا يتم تحليلها، ولكن فقط تلك التي يتم التقاطها. وهكذا، فإن اختيار مستضد يتم من خلالها القبض على virions أو المركبات الكهربائية يصبح بالغ الأهمية. أيضا، وتدفق خلافا الخلوي عدد مستضدات مختلفة (عدد الأجسام المضادة الفلورسنت ضد مستضدات مختلفة) يقتصر من قبل على سطح صغير من virions أو المركبات الكهربائية. وأخيرا، قد الأجسام المضادة المختلفة تتداخل sterically مع بعضها البعض مرة أخرى نظرا لمساحة صغيرة (مقارنة مع الخلايا).
ويمكن تكييف البروتوكول الحالي لتحليل أي فيروس أو EV من أي منشأ، شريطة أن الأجسام المضادة المحددة التي من خلالها يمكن الحصول عليها متوفرة. تحليل المستضدات على تصريح virions الفرديةالصورة الباحثين لمعالجة التسبب في كسور مختلفة من السكان الفيروسية. وعلاوة على ذلك، وتحديد المركبات الكهربائية الفردية في البلازما قد تجعل من الممكن لتتبع أصل المركبات الكهربائية لخلايا معينة وتقديم تقرير حول ظروف طبيعية أو مرضية من هذه الخلايا والأجهزة التي يقيمون فيها.
The authors have nothing to disclose.
This work of AA, SZ, WF, J-C.G, and LM was supported by the NICHD Intramural Program. The work of MV was supported by the Russian Federation Government grant #14.B25.31.0016.
Materials | |||
Carboxyl Magnetic Iron Oxide Nanoparticles Conjugation Kits | Ocean Nanotech | ICK-15-005 | |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | Millipore | UFC810024 | |
5mL Round Bottom PP Test Tube, without Cap | Falcon | 352002 | |
DEPC treated water | Quality Biological | 351-068-131 | |
SuperMAG-01 magnetic separator | Ocean Nanotech | SuperMAG-01 | |
Zenon R-Phycoerythrin Mouse IgG1 Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | Z25055 | |
Nanosep Centrifugal Devices with Omega Membrane 100k | Pall Corp | OD100C34 | |
EDTA 0.5M | Corning Cellgro | 46-034-CI | |
Bovine Serum Albumin solution | Sigma-Aldrich | A9576-50ML | |
PBS | Gibco | 10010-23 | |
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified | EMS | 15710 | |
123count eBeads | eBioscience | 01-1234-42 | |
CytoCount beads | Dako | S2366 | |
AccuCheck count beads | Invitrogen | PCB100 | |
Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (CST) | BD Bioscience | 642412 | |
Vybrant DiI Cell-Labeling Solution | Thermo Fisher Scientific | V22885 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
µMACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-701 | |
OctoMACS Separator magnet | Miltenyi Biotec | 130-042-108 | |
Nanodrop | ThermoFisher | none | |
NanoSight NS300 | Malvern | none | |
BD LSRII flow cytometer | BD Bioscience | none | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Flowjo software | Flowjo | ||
BD FACSDiva software | BD |