Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles coupled to antibodies recognizing surface antigens. The captured virions or vesicles were labeled with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated in high magnetic field and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence.
Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of some of the EVs. Both virions and EVs carry proteins of the cells that generated them and are antigenically heterogeneous. In spite of their diversity, both viruses and EVs were characterized predominantly by bulk analysis. Here, we describe an original nanotechnology-based high throughput method that allows the characterization of antigens on individual small particles using regular flow cytometers. Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles (MNPs) coupled to antibodies recognizing one of the surface antigens. The captured virions or vesicles were incubated with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated on magnetic columns from unbound antibodies and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence. This method has wide applications and can be used to characterize the antigenic composition of any viral- and non-viral small particles generated by cells in vivo and in vitro. Here, we provide examples of the usage of this method to evaluate the distribution of host cell markers on individual HIV-1 particles, to study the maturation of individual Dengue virions (DENV), and to investigate extracellular vesicles released into the bloodstream.
Cellen in meercellige organismen vele verschillende elementen die ofwel uniek zijn voor een bepaalde cel of althans tot unieke groepen cellen. Zelfs gekweekte gekloonde cellen vertonen individuele kenmerken, zoals blijkt uit hun diverse morfologie. Ook is een cel individualiteit terug in de producten hij scheidt. In het geval van virale infecties, kunnen virusdeeltjes eiwitten uit de cellen waarin ze ontstonden dragen. Bijvoorbeeld, HIV vele gastheerceleiwitten zijn ingebed in de virale envelop en virussen die zijn gegenereerd door verschillende cellen kunnen deze karakteristieke eiwitten dragen 1, 2 of "cel handtekeningen".
Zelfs zonder infectie, cellen vrijkomen in de omringende media kleine extracellulaire blaasjes (EV's). Biogenese van deze vesicles en de structuur vaak lijken op die van virussen, met name retrovirussen. In de afgelopen jaren is duidelijk gewordendat EV, die aanvankelijk werden beschouwd "bloedplaatjes dust" 3, zijn een belangrijk fysiologisch systeem van cel-cel communicatie. Samen met twee andere systemen van intercellulaire communicatie, namelijk de cel-cel contact interacties en vrijgelaten oplosbare moleculen, EV's coördineren normale fysiologie en worden veranderd in verschillende pathologieën 4, 5 met inbegrip van virale infecties 6, 7.
Hoewel beide vrijgegeven virusdeeltjes en extracellulaire vesicles zijn zeer divers, worden ze voornamelijk gekenmerkt door bulkanalyse waarin de individuele kenmerken verloren gaan. Werkwijze verwant aan flowcytometrie, die cellen op basis van hun verschillende oppervlakteantigenen fenotypen, nodig om individuele virale en virusachtige partikels te karakteriseren. Helaas, EV's of kleine virions niet kan worden geanalyseerd met behulp van standaard stroming cytometrie methoden omdat zij te klein om de lichtverstrooiende signaal waarop de meeste cytometers rekenen voor triggering genereren. Om deze beperking te omzeilen, kan fluorescentie triggering worden toegepast. Indien EV of virions worden gekleurd met fluorescente antilichamen moeilijk te onderscheiden van vrije antilichamen en aggregaten vanwege hun vergelijkbare fluorescentie en vergelijkbare afmetingen.
Onlangs hebben we een op nanotechnologie gebaseerde high throughput methode die de karakterisering van antigenen op de individuele kleine deeltjes met behulp van reguliere flowcytometers 8, 9 toelaat. We gebruiken MNP's op immunocapture deeltjes plaats, zoals is beschreven door andere groepen voor uiteenlopende toepassingen 10, 11, 12, 13; maar onze nieuwe techniek maakt het vangen van afzonderlijke speciFIC targets gevolgd door fenotypering van deze gevangen deeltjes door middel van flowcytometrie met behulp van fluorescentie triggeren plaats van lichtverstrooiing, zonder inmenging van vrij zwevende antilichamen. Deze methode heeft brede toepassingen en kan worden gebruikt om de antigene samenstelling volgens viral- en niet-virale kleine deeltjes gegenereerd door cellen in vivo te karakteriseren en in vitro verschaft de beschikbaarheid van specifieke fluorescente antilichamen tegen oppervlakteantigenen. We hebben al deze techniek een aantal biologische problemen te bestuderen toegepast.
Met name evalueerden wij de verdeling van de gastheercel merkers op afzonderlijke HIV-1 deeltjes 9, hebben we de rijping van individuele Dengue virus (DENV) gebaseerd op een analyse van hun oppervlakte-eiwitten 14 en onderzocht EV vrijkomen in de bloedstroom van gezonde vrijwilligers en patiënten met een acuut coronair syndroom (ACS). Hoewel gebaseerd op een soortgelijk principe, detoepassing van de nieuwe techniek vereiste ontwikkeling van specifieke protocollen die hieronder worden beschreven.
Conventionele flowcytometers blijven belangrijk instrument voor het analyseren van de cellen op basis van hun fysische en chemische eigenschappen op individueel niveau 18. De basisprincipes van flowcytometrie zijn niet veranderd sinds de ontwikkeling ervan: een cel die door de laserstraal passeert en verstrooit licht vormt een gebeurtenis die de opname van de fluorescerende spectra uitgezonden door celgebonden fluorescerende antilichamen triggers. Kleinere deeltjes van minder dan 300 nm kan niet worden gedetecteerd door zijwaartse verstrooiing van een cytometer als ze meer licht verstrooien onder grotere hoeken waarop de meeste flowcytometer niet licht 18 te verzamelen. De hier beschreven techniek, maakt de identificatie en de analyse van veelvoudige antigenen op tal van individuele virussen of EV's met conventionele flowcytometers met fluorescentie triggering.
De kritische stappen in het protocol zijn de koppeling van antilichamen tegen MNP. Onze experimenten werden Performed middels 15 nm ijzeroxide nanodeeltjes met carbonzuur als een reactieve groep zoals eerder beschreven 9. Volgens de fabrikant, kan elke 15 nm MNP maximaal 20 antilichamen binden; we binden ongeveer 10 antilichamen per 15 nm MNP. Deze schatting is gebaseerd op de hoeveelheid antilichamen voor en na koppeling en het aantal kralen / ml zoals gemeten door karakterisering van nanodeeltjes en dimensionering instrumentatie. In principe kunnen koppelen aggregatie van deeltjes veroorzaken en is ongewenst. Om te controleren dat de samenvoeging gebeurt niet met ons protocol, geverifieerd we dit met karakterisering van nanodeeltjes en dimensionering instrumentatie. Dit instrument meet de hydrodynamische diameter van de deeltjes die de coating en antilichaam lagen en niet alleen de kern 15 nm omvat. We vonden dat het merendeel van de gekoppelde kralen bevinden zich op een enkele piek (gemiddelde piek bij 64,7 ± 4,2 nm met 90% van alle gebeurtenissen onder 73 ± 7.3 nm). Het mengen van Ab-MNP complexes met virionen of EV in de juiste verhouding is belangrijk, zodat MNP's in de concentratie van enkele orden hoger dan EV / virions. Dit is essentieel om te verzekeren dat enkel EV / virionen geanalyseerd. Vermijd toevalligheden van de gebeurtenissen door het uitvoeren van cytometer bij lage flow. Zorgen voor de verwerving ter fluorescentie activeren en gebruiken volumetrische controles om de concentratie van de gevangen entiteiten meten.
Echter, MNP's EV of virions aggregeren door verknoping of door de binding van twee of meer virionen dezelfde nanodeeltjes. Om dit te controleren, een test voor aggregatie zoals beschreven in figuur 4 moet worden uitgevoerd. Zelfs individueel gevangen virionen of EV's kunnen gelijktijdig voer de laserstraal van de flowcytometer. Dit zou valse positiviteit maken twee verschillende antigenen. Om dit te voorkomen, dient de flowcytometer worden ingesteld zoals beschreven en de preparaten worden verdund. Men kan controleren of het toeval gebeurt door gebruik te maken van dezelfdestrategie zoals beschreven in het vorige punt. Ook zou het ontbreken van coïncidentie worden gecontroleerd door analyse van seriële verdunningen van het preparaat en bewijzen dat het aantal gebeurtenissen neemt lineair met de verdunning terwijl de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van een fluorescerend gekleurd antigeen constant verdunningen (figuur 5) blijft. Een ander probleem is dat er te weinig virussen / EV's kunnen worden vastgelegd. Dit kan te wijten zijn aan de werkelijke schaarste van virussen / EV die antigenen waardoor deze vastlegt specifieke MNP's dragen. Als alternatief kan de efficiëntie van opname laag is om verschillende redenen (bijvoorbeeld inefficiënte koppeling van antilichamen tegen MNP's, afwijking van de verhoudingen van MNP's op virions / EV's ontwikkeld voor dit protocol, etc.). Om deze mogelijkheid te voorkomen, moet de efficiëntie van opname specifiek geëvalueerd. Gewoonlijk moet de efficiëntie ongeveer 90% als in figuur 6.
Verschillende antilichamen kunnen verstoren doorsterische hindering met elkaar of met de antilichamen gekoppeld aan MNP's. Om te controleren dat dit niet gebeurde een reverse capture protocol moet worden getest (zoals beschreven in hoofdstuk 7. In het kort, virionen of EV's moet eerst worden gekleurd met fluorescerende detectie Abs en vervolgens gevangen genomen door Ab-MNP complexen met nascheiding van vrije drijvende Abs op magnetische kolommen.
Flow virometry heeft belangrijke voordelen ten opzichte van bestaande methoden van de analyse van de antigene samenstelling van virions of EV's. Routinematige biochemische werkwijzen rapporteren over de algemene aanwezigheid van bepaalde eiwitten in de preparaten, maar geven geen informatie over de heterogeniteit van de virions of EV. Dit omvat immunocapture van virions of EV's op grote handel verkrijgbare deeltjes. Dergelijke deeltjes zijn typisch van enkele microns in diameter en elk van hen kan honderden of duizenden virions of EV vangen. Daarom is elke latere analyse gemiddelden de eigenschappen van de virions / EVgevangen genomen door één deeltje. Daarentegen stroom virometry gebruikt MNP's van 10-15 nm in diameter en met de beschreven protocol ten minste 90% van gebeurtenissen een enkelvoudige virion of één EV.
De voornaamste beperking is dat de volledige populatie van virions of EV in de bereiding niet kan worden geanalyseerd, maar alleen die wordt opgepikt. Zo is de keuze van het antigeen waardoor virionen of EV worden opgevangen kritiek wordt. Ook is in tegenstelling tot flowcytometrie het aantal verschillende antigenen (het aantal fluorescerende antilichamen tegen verschillende antigenen) beperkt door het kleine oppervlak van virionen of EV. Tenslotte kunnen verschillende antilichamen sterisch hinderen elkaar weer vanwege de kleine (vergeleken met de cellen) oppervlak.
Het huidige protocol kan worden aangepast voor analyse van virussen of EV van elke oorsprong, mits de specifieke antilichamen waardoor ze kunnen worden opgenomen zijn. Analyse van de antigenen op individuele virions vergunnings onderzoekers aan de pathogenese van verschillende fracties van virale populaties pakken. Bovendien kan identificatie van individuele EV in plasma het mogelijk de oorsprong van EV om bepaalde cellen te traceren en bericht normale of pathologische omstandigheden van deze cellen en de organen waar zij verblijven.
The authors have nothing to disclose.
This work of AA, SZ, WF, J-C.G, and LM was supported by the NICHD Intramural Program. The work of MV was supported by the Russian Federation Government grant #14.B25.31.0016.
Materials | |||
Carboxyl Magnetic Iron Oxide Nanoparticles Conjugation Kits | Ocean Nanotech | ICK-15-005 | |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | Millipore | UFC810024 | |
5mL Round Bottom PP Test Tube, without Cap | Falcon | 352002 | |
DEPC treated water | Quality Biological | 351-068-131 | |
SuperMAG-01 magnetic separator | Ocean Nanotech | SuperMAG-01 | |
Zenon R-Phycoerythrin Mouse IgG1 Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | Z25055 | |
Nanosep Centrifugal Devices with Omega Membrane 100k | Pall Corp | OD100C34 | |
EDTA 0.5M | Corning Cellgro | 46-034-CI | |
Bovine Serum Albumin solution | Sigma-Aldrich | A9576-50ML | |
PBS | Gibco | 10010-23 | |
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified | EMS | 15710 | |
123count eBeads | eBioscience | 01-1234-42 | |
CytoCount beads | Dako | S2366 | |
AccuCheck count beads | Invitrogen | PCB100 | |
Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (CST) | BD Bioscience | 642412 | |
Vybrant DiI Cell-Labeling Solution | Thermo Fisher Scientific | V22885 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
µMACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-701 | |
OctoMACS Separator magnet | Miltenyi Biotec | 130-042-108 | |
Nanodrop | ThermoFisher | none | |
NanoSight NS300 | Malvern | none | |
BD LSRII flow cytometer | BD Bioscience | none | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Flowjo software | Flowjo | ||
BD FACSDiva software | BD |