Klinik Öncesi Bir Murin Modeli İçin Cerrahi Prosedürler ve Metodoloji<emDe Novo</emMeme Kanseri Metastazı
Summary
Meme kanseri metastazını hedef alan adjuvan tedaviyi değerlendiren klinik öncesi modeller eksiktir. Buna değinmek için, de novo pulmoner meme adenokarsinom metastazına ait bir fare modeli geliştirdik, burada adjuvan ortamında (primer tümörlerin cerrahi sonrası rezeksiyonu) uygulanan terapiler önceden tohumlanmış pulmoner metastazları etkilemek için etkinlik açısından değerlendirilebilir.
Abstract
A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study end-points. Thus, studies focused on elucidating mechanisms of late-stage de novo metastasis are compromised, as are studies examining efficacy of anti-cancer therapies targeting mediators of metastasis in the adjuvant setting. Numerous murine mammary cancer models have been developed via targeted expression of dominant oncoproteins to mammary epithelial cells yielding models variably mimicking histopathologic and transcriptome-defined breast cancer subtypes common in women1. While much has been learned regarding the biology of mammary carcinogenesis with these models, their utility in identifying molecules regulating growth of late-stage metastasis are compromised as mice are typically euthanized at earlier time points due to significant primary tumor burden. Moreover, since a significant percentage of women diagnosed with breast cancer receive adjuvant therapy after surgical resection of primary tumors and prior to presence of detectable metastatic disease, preclinical models of de novo metastasis are urgently needed as platforms to evaluate new therapies aimed at targeting metastatic foci. To address these deficiencies, we developed a murine model of de novo mammary cancer metastasis, wherein primary mammary tumors are surgically resected, and metastatic foci subsequently develop over a 115 day post-surgical period. This long latency provides a tractable model to identify functionally significant regulators of metastatic progression in mice lacking primary tumor, as well as a model to evaluate preclinical therapeutic efficacy of agents aimed at blocking functionally significant molecules aiding metastatic tumor survival and growth.
Introduction
Kuzey Amerika'daki kadınların yaşam boyu% 12 oranında meme kanseri riski 2 vardır ; Bu kişilerin çoğunluğunun ameliyat yoluyla primer tümörler çıkarılacağı ve kanser alt tipine bağlı olarak adjuvan ortamında hedefe bağlı, endokrin, kemo ve / veya radyoterapi alacağı 3 . Örnekler, anti-östrojen terapileri alan hormon reseptörü pozitif kanserler tanısı konan kadınlar ve radyasyon / kemoterapi ile HER2 hedefli terapiler alan HER2 pozitif tümörleri olan kadınlar olmakla birlikte, üçlü negatif tümörler için henüz hedeflenmiş tedaviler mevcut değildir 3 . Radyasyon, kemoterapi, kişiselleştirilmiş ve hormonal esaslı cerrahi rezeksiyon eklemelerindeki ilerlemelere rağmen, evre II veya III hastalık 4 olarak teşhis edilen kadınların% 30-70'inde hastalık tekrar eder; çünkü terapiler uzak organlarda metastatik hastalığın ortadan kaldırılmasında büyük ölçüde etkisizdir; Akciğer, kemik, bYağmur ve / veya karaciğer 5 . Metastatik hastalık primer tümör yeniden büyümesinin olmaması durumunda ortaya çıktığı zaman bu, özellikle önemli bir konudur; bu da, kesin ameliyat sırasında, dissemine malign hücrelerin muhtemelen ikincil organlarda zaten mevcut olduğunu ima eder. Bu nedenle, metastatik tümörlerin yok olmasını veya yavaş büyümesini sağlayabilen terapilere acilen ihtiyaç vardır.
Meme karsinogenezisin de novo fare modelleri, neoplastik ilerlemesinin 1 düzenleyen mekanizmaların açığa dikkat çekecek derecede bilgilendirici olmuş olmakla mevcut modeller ayrıca çeşitli sınırlamalara sahiptir. Bunlardan biri, de novo transgenik modellerin tipik olarak birden fazla meme bezi içerisinde primer tümörler geliştirdiği gerçeğidir; burada primer tümör yükü çalışma sürelerini sınırlar. Primer tümör hücresi kaçışı ve metastatik tohumlama, muhtemelen bu modellerde neoplastik progresyonun erken döneminde ortaya çıkarken, metastatik tümörlerin açık gelişimi geç ortaya çıkar veFare modeli ve gerinim arka planı, çoğunlukla kısmen penetrantır 1 . Bu ayrıca, ikincil organlarda metastazı düzenleyen moleküllerin keşfi için de novo modellerin kullanımını sınırlar ve adjuvan ortamında önleyici etkinliğin değerlendirilmesi için sınırlandırılır.
Bu kısıtlamaları ortadan kaldırmak için, akciğerlere yönelik meme kanseri metastazının de novo otonom modeli geliştirdik. Son evre de novo meme tümörleri taşıyan ebeveyn transgenik dişiler (diğer bir deyişle , burada açıklanan çalışmalar için FVB / n suşu zemininde MMTV-PyMT) yaklaşık 100 gün 6 yaşlandırılır ve bu noktada primer tümörler cerrahi olarak rezeke edilir ve enzimatik olarak Tek hücreli süspansiyonlar. Süspansiyonlar (1 x 10 6 hücre) sırayla ortotopik olarak 6-7 haftalık alıcı eş merkezli dişi farelere eksplane edilir ve burada tekli primer meme tümörleri 38 ila 60 günlük süre boyunca gelişir ( <stronG class = "xfig"> Şekil 1A). Tayin edilmiş bir tümör boyutu olarak (172, 450 ila 3 mm), alıcı farelere anestezi yapılır ve primer tümörler cerrahi cerrahi alanda tümörün yeniden büyüdüğü kadınlarda cerrahi (Ek Şekil 1) ile uyumlu, en aza inecek şekildedir çıkartılmaktadır. Fareler, FVB / n suşu zemininde, ameliyat sonrası ~ 115 gün boyunca% 45 penetransli akciğerlerde histolojik olarak saptanabilir metastatik odak gelişir ( Şekil 1B ). Metastatik tümör büyümesinin uzatılmış gecikmesi ile model, adjuvan tedavi sunumu için ve primer tümörlerin cerrahi olarak çıkarılmasını takiben metastatik ilerlemeyi etkileyen biyolojiyi aydınlatmak ve değerlendirmek için benzersiz bir şekilde konumlandırılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Değişiklikler ve sorun giderme:
Tümör karın duvarından uzak künt diseksiyon yaparken, tümör karın duvarına yapışmış kalabilir. Bu, tümör enjekte edilen farelerin <% 5'inde gözlenmiştir (veriler gösterilmemiştir). Karın duvarına yapışık tümörleri olan fareler için, fare, birincil tümör yeniden büyümesi olmaksızın rezeksiyon zor olduğu için ötenazi yapılmalıdır.
Model / teknik sınırlamaları…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, histopatoloji yardımı için Jo Hill'e, ameliyat tekniği eğitimi için Dr. John Gleysteen'e, videografi yardımı için Tessa Diebel'e, eleştirel görüş ve tartışmalar için Wong ve Coussens laboratuvarlarının tüm üyelerine ve mali destek için OHSU Knight Cancer Institute'a teşekkür ederler. Yazarlar, T32GM071388-10 ve T32CA106195-11'den CEG'e, NCI / NIH'ye, Savunma Bakanlığı Göğüs Kanseri Araştırma Programı'na, Susan G Komen Vakfı'na, Meme Kanseri Araştırma Vakfı'na ve Bir Kansere Karşı Stand Up – Lustgarten Vakfına verdikleri desteği onaylarlar MHW'ye Vakfı Ödüllendiren Kadın Sağlığı Çemberi olan LMC'ye ve MHW'ye ve LMC'ye Brenden-Colson Pankreas Sağlığı Merkezi'ne Pankreas Kanseri Yakınsama Düşü Ekipleri Translasyonel Araştırma Granti (SU2C-AACR-DT14-14) verdi.
Materials
| Isofluorane | Piramal Healthcare | N/A | Prescription order |
| Collagenase A | Roche | 11088793001 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| DMEM | ThermoFisher | 12634010 | |
| 25 mL Pyrex bottle | Sigma-Aldrich | CLS139525 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Bio | S11150 | |
| 0.7 µm nylon strainer | Corning | 352350 | |
| 50 mL conical tube | VWR | 89039-658 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | BD | 354230 | Growth factor-reduced solubilized basement membrane preparation extracted from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma |
| Poly(vinylpyrrolidone)–Iodine complex | Sigma-Aldrich | PVP1 | |
| 29 gauge 0.3 mL insulin syringe | BD | 324702 | |
| Small Vessel Cauterizer Kit | FST | 18000-00 | |
| Wound clips | Texas Scientific | 205016 | |
| AutoClip wound clip applier | BD | 427630 | |
| AutoClip wound clip remover | BD | 427637 | |
| Bromodeoxyuridine | Roche | 10280879 | |
| Heparinized capillary tubes | Fisher | 22362566 | |
| Microtainer tubes with dipotassium EDTA | BD | 365974 | |
| 20 mL syringe | BD | 309661 | |
| DPBS | Thermo-Fisher | 14190-250 | |
| OCT-freezing medium | VWR | 25608930 | |
| Formalin, Buffered, 10% (Phosphate Buffer) | Fisher | SF100-4 | |
| 23g needle | Fisher | 14-826-6B | |
| FVB/n mouse | Jackson Laboratories | 001800 |
References
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Res. 8, 212 (2006).
- Howlader, N. N. A., Krapcho, M. . SEER Cancer Statistics Review 1975-2008. , (2011).
- National Comprehensive Cancer Network. . Breast Cancer (Version 3.2014). , (2016).
- Kataja, V., Castiglione, M., Group, E. G. W. Locally recurrent or metastatic breast cancer: ESMO clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 19 Suppl 2, 11-13 (2008).
- Margolese, R. G., Hortobagyi, G. N., Buchholz, T. A., Kufe, D. W., Pollock, R. E., Weichselbaum, R. R. . Management of Metastatic Breast Cancer. Holland-Frei Cancer Medicine. , (2003).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Mol Cell Biol. 12, 954-961 (1992).
- Kouros-Mehr, H., et al. GATA-3 links tumor differentiation and dissemination in a luminal breast cancer model. Cancer Cell. 13, 141-152 (2008).
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the lung. Nature. 436, 518-524 (2005).
- Qian, B. Z., et al. FLT1 signalling in metastasis-associated macrophages activates an inflammatory signature that promotes breast cancer metastasis. J Exp Med. 212 (9), 1433-1448 (2015).
- Verkooijen, H. M., et al. Patients’ refusal of surgery strongly impairs cancer survival. Ann Surg. 242 (2), 276-280 (2005).
- Peinado, H., et al. Pre-metastatic niches: organ-specific homes for metastasis. Nat Rev Cancer. 17 (5), 302-317 (2017).
