כירורגית נהלים ומתודולוגיה עבור מודל Murlin פרה קלינית של<em> דה נובו</em> גרורות סרטן החלב
Summary
מודלים פרה-קליניים המעריכים טיפול אדג'ובנטי למיקוד גרורות לסרטן השד נעדרים. כדי להתמודד עם זה, פיתחנו מודל Murine של novo ריאתי אדמוקרצינומה החלב ריאתי, שבו טיפולים שניתנו הגדרה אדג'ובנטית (כריתה כירורגית לאחר ניתוח) ניתן להעריך את היעילות להשפיע על גרורות בעבר ריאתי seeded.
Abstract
A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study end-points. Thus, studies focused on elucidating mechanisms of late-stage de novo metastasis are compromised, as are studies examining efficacy of anti-cancer therapies targeting mediators of metastasis in the adjuvant setting. Numerous murine mammary cancer models have been developed via targeted expression of dominant oncoproteins to mammary epithelial cells yielding models variably mimicking histopathologic and transcriptome-defined breast cancer subtypes common in women1. While much has been learned regarding the biology of mammary carcinogenesis with these models, their utility in identifying molecules regulating growth of late-stage metastasis are compromised as mice are typically euthanized at earlier time points due to significant primary tumor burden. Moreover, since a significant percentage of women diagnosed with breast cancer receive adjuvant therapy after surgical resection of primary tumors and prior to presence of detectable metastatic disease, preclinical models of de novo metastasis are urgently needed as platforms to evaluate new therapies aimed at targeting metastatic foci. To address these deficiencies, we developed a murine model of de novo mammary cancer metastasis, wherein primary mammary tumors are surgically resected, and metastatic foci subsequently develop over a 115 day post-surgical period. This long latency provides a tractable model to identify functionally significant regulators of metastatic progression in mice lacking primary tumor, as well as a model to evaluate preclinical therapeutic efficacy of agents aimed at blocking functionally significant molecules aiding metastatic tumor survival and growth.
Introduction
לנשים בצפון אמריקה יש סיכון של 12% לכל החיים לפתח סרטן שד 2 ; רוב האנשים האלה יהיו גידולים ראשוניים הוסרו באמצעות ניתוח, ובהתאם לסוג הסרטן, לאחר מכן יקבלו טיפול ממוקד, אנדוקריני, כימותרפיה ו / או הקרנות בסביבה אדג'ובנטית 3 . דוגמאות לכך כוללות נשים המאובחנות בסרטן חיובי של קולטן הורמון המקבל טיפולים נגד אסטרוגן ונשים עם גידולים חיוביים ל- HER2 המקבלים טיפולים המבוססים על HER2 עם הקרנות / כימותרפיה, בעוד שאף טיפולים ממוקדים אינם זמינים עדיין לגידולים שליליים שליליים 3 . למרות ההתקדמות בקרינה, כימותרפיה, טיפולים מותאמים אישית והורמונים המשלימים כריתה כירורגית, המחלה חוזרת ב -30% -70% מהנשים המאובחנות עם מחלת שלב II או III 4 , מכיוון שהטיפולים אינם יעילים במידה רבה במיגור מחלות גרורות באיברים מרוחקים, כולל ריאה, עצם, bגשם ו / או כבד 5 . זה משמעותי במיוחד בהתחשב בכך שכאשר מחלת גרורות מתרחשת בהעדר גידול מחודש של הגידול, משמעות הדבר היא שתאים ממאירים מופצים היו קיימים כבר באיברים משניים בזמן הניתוח הסופי. לכן טיפולים מסוגלים לחסל או להאט את הצמיחה של גידולים גרורתיים נדרשים בדחיפות.
בעוד מודלים העכבר נובו של קרצינוגנזה החלב כבר אינפורמטיבי להפליא מנגנוני חשיפת ויסות התקדמות ניאופלסטית 1 , מודלים קיימים גם מספר מגבלות. אחד מהם הוא העובדה כי דה novo מודלים מהונדס בדרך כלל לפתח גידולים ראשוניים בבלוטות החלב מרובים, שבו הגידול הראשוני נטל מגבלות משך הלימודים. בעוד שתא הגידול העיקרי בתאי הזרע הגרורתי עשוי להתרחש מוקדם בהתקדמות ניאופלסטית במודלים אלו, התפתחות גלויה של גידולים גרמניים מתרחשת מאוחר,N את מודל העכבר ואת רקע זן, הוא לעתים קרובות חלקית החדירה 1 . זה עוד מגביל את התועלת של מודלים של נובו לגילוי של מולקולות המסדירות גרורות באיברים משניים, וכן להערכת יעילות פרה קלינית של טיפולים בסביבה adjuvant.
כדי לעקוף את המגבלות הללו, פיתחנו מודל נוטו autochthonous של גרורות קרצינומה החלב לריאות. אמהות מהונדסות מהונדס ( כלומר , MMTV-PyMT על רקע FVB / n זן למחקרים המתוארים כאן) הנושא בשלב מאוחר של גידולי החלב novo הם בגילאי ~ 100 ימים 6 , ובנקודה שבה גידולים העיקריים שלהם הם resected כירורגי ו ניתק באופן אנזימטי לתוך תא יחיד השעיות. השעיות (1 x 10 6 תאים) הם בתורו autantotopically explanted לתוך 6-7 בן מקבלי נקבה עכברים syngeneic, שבו אחד גידולי החלב העיקרית לפתח על 38-60 יום תקופה ( <stronG class = "xfig"> איור 1 א). בגודל של גידול מוגדר (172 עד 450 מ"מ 3 ), עכברים מקבלים מורדמים וגידולים ראשוניים הם resected כירורגי כך לצמיחה מחודשת של הגידול באתר כירורגית ממוזער, עולה בקנה אחד עם ניתוח בנשים ( איור משלים 1 ). על רקע FVB / n זן, עכברים לפתח foci גרורתי היסטולוגית הריאות עם החדירה 45% על ידי ~ 115 ימים לאחר הניתוח ( איור 1 ב ). עם זמן חביון ממושך זה של גידול גידולי גרורתי, המודל ממוקם באופן ייחודי עבור מתן טיפול אדג'ובנטי, וכן להבהרה והערכת ביולוגיה בסיסית המשפיעים על התקדמות גרורת בעקבות הסרה כירורגית של גידולים ראשוניים.
Protocol
Representative Results
Discussion
שינויים ופתרון בעיות:
כאשר בוטה לנתח את הגידול במרחק של דופן הבטן, הגידול עשוי להישאר דבקים בדופן הבטן. זה נצפתה <5% של עכברים מוזרק גידול (נתונים לא מוצג). עבור עכברים עם גידולים הדבקים בקיר הבטן, העכבר צריך להיות מורדמים…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לג'ו היל על סיוע בהיסטופתולוגיה, ד"ר ג'ון גלייסטין על הוראה בשיטות כירורגיות, טסה דייבל לסיוע בווידאו, כל חברי המעבדות של וונג וקוזנס על תובנות ודיונים ביקורתיים, ועל מכון OHSU Knight Cancer לתמיכה כספית. המחברים מאשרים תמיכה של T32GM071388-10 ו- T32CA106195-11 ל- CEG, NCI / NIH, המחלקה לחקר סרטן השד תוכנית המחקר, קרן סוזן ג 'קומן, הקרן לחקר סרטן השד וקרן לוסטיגרטן סרטן הלבלב התכנסות חלום צוות מענק מחקר תרגום (SU2C-AACR-DT14-14) ל LMC, מענק בריאות האישה של הענקת קרן MHW, ואת מרכז Brenden-Colson לבריאות הלבלב MHW ו LMC.
Materials
| Isofluorane | Piramal Healthcare | N/A | Prescription order |
| Collagenase A | Roche | 11088793001 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| DMEM | ThermoFisher | 12634010 | |
| 25 mL Pyrex bottle | Sigma-Aldrich | CLS139525 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Bio | S11150 | |
| 0.7 µm nylon strainer | Corning | 352350 | |
| 50 mL conical tube | VWR | 89039-658 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | BD | 354230 | Growth factor-reduced solubilized basement membrane preparation extracted from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma |
| Poly(vinylpyrrolidone)–Iodine complex | Sigma-Aldrich | PVP1 | |
| 29 gauge 0.3 mL insulin syringe | BD | 324702 | |
| Small Vessel Cauterizer Kit | FST | 18000-00 | |
| Wound clips | Texas Scientific | 205016 | |
| AutoClip wound clip applier | BD | 427630 | |
| AutoClip wound clip remover | BD | 427637 | |
| Bromodeoxyuridine | Roche | 10280879 | |
| Heparinized capillary tubes | Fisher | 22362566 | |
| Microtainer tubes with dipotassium EDTA | BD | 365974 | |
| 20 mL syringe | BD | 309661 | |
| DPBS | Thermo-Fisher | 14190-250 | |
| OCT-freezing medium | VWR | 25608930 | |
| Formalin, Buffered, 10% (Phosphate Buffer) | Fisher | SF100-4 | |
| 23g needle | Fisher | 14-826-6B | |
| FVB/n mouse | Jackson Laboratories | 001800 |
References
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Res. 8, 212 (2006).
- Howlader, N. N. A., Krapcho, M. . SEER Cancer Statistics Review 1975-2008. , (2011).
- National Comprehensive Cancer Network. . Breast Cancer (Version 3.2014). , (2016).
- Kataja, V., Castiglione, M., Group, E. G. W. Locally recurrent or metastatic breast cancer: ESMO clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 19 Suppl 2, 11-13 (2008).
- Margolese, R. G., Hortobagyi, G. N., Buchholz, T. A., Kufe, D. W., Pollock, R. E., Weichselbaum, R. R. . Management of Metastatic Breast Cancer. Holland-Frei Cancer Medicine. , (2003).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Mol Cell Biol. 12, 954-961 (1992).
- Kouros-Mehr, H., et al. GATA-3 links tumor differentiation and dissemination in a luminal breast cancer model. Cancer Cell. 13, 141-152 (2008).
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the lung. Nature. 436, 518-524 (2005).
- Qian, B. Z., et al. FLT1 signalling in metastasis-associated macrophages activates an inflammatory signature that promotes breast cancer metastasis. J Exp Med. 212 (9), 1433-1448 (2015).
- Verkooijen, H. M., et al. Patients’ refusal of surgery strongly impairs cancer survival. Ann Surg. 242 (2), 276-280 (2005).
- Peinado, H., et al. Pre-metastatic niches: organ-specific homes for metastasis. Nat Rev Cancer. 17 (5), 302-317 (2017).
