Procedimientos quirúrgicos y metodología para un modelo murino preclínico<em> De Novo</em> Metástasis del cáncer mamario

Summary

Los modelos preclínicos que evalúan la terapia adyuvante dirigida a la metástasis del cáncer de mama están ausentes. Para tratar esto, se desarrolló un modelo murino de metástasis de adenocarcinoma mamario pulmonar de novo , en el que se pueden evaluar las terapias administradas en la configuración adyuvante (resección postquirúrgica de tumores primarios) en cuanto a eficacia en el impacto de metástasis pulmonares previamente sembradas.

Abstract

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study end-points. Thus, studies focused on elucidating mechanisms of late-stage de novo metastasis are compromised, as are studies examining efficacy of anti-cancer therapies targeting mediators of metastasis in the adjuvant setting. Numerous murine mammary cancer models have been developed via targeted expression of dominant oncoproteins to mammary epithelial cells yielding models variably mimicking histopathologic and transcriptome-defined breast cancer subtypes common in women¹. While much has been learned regarding the biology of mammary carcinogenesis with these models, their utility in identifying molecules regulating growth of late-stage metastasis are compromised as mice are typically euthanized at earlier time points due to significant primary tumor burden. Moreover, since a significant percentage of women diagnosed with breast cancer receive adjuvant therapy after surgical resection of primary tumors and prior to presence of detectable metastatic disease, preclinical models of de novo metastasis are urgently needed as platforms to evaluate new therapies aimed at targeting metastatic foci. To address these deficiencies, we developed a murine model of de novo mammary cancer metastasis, wherein primary mammary tumors are surgically resected, and metastatic foci subsequently develop over a 115 day post-surgical period. This long latency provides a tractable model to identify functionally significant regulators of metastatic progression in mice lacking primary tumor, as well as a model to evaluate preclinical therapeutic efficacy of agents aimed at blocking functionally significant molecules aiding metastatic tumor survival and growth.

Introduction

Las mujeres en América del Norte tienen un 12% de riesgo de por vida ~ de desarrollar cáncer de mama ^2; Una mayoría de estos individuos tendrán tumores primarios quitados vía cirugía, y dependiendo del subtipo del cáncer, recibirán entonces endocrino, endocrino, quimioterapia y / o radioterapia en el ajuste adyuvante ³ . Entre los ejemplos se incluyen las mujeres diagnosticadas con cánceres receptores hormonales positivos que reciben terapias anti-estrógenos y las mujeres con tumores positivos a HER2 que reciben terapias dirigidas a HER2 con radiación / quimioterapia, mientras que todavía no se dispone de terapias dirigidas para tumores triples negativos ³ . A pesar de los avances en radioterapia, quimioterapia, terapias personalizadas y basadas en hormonas que complementan la resección quirúrgica, la enfermedad se repite en el 30-70% de las mujeres diagnosticadas con enfermedad en estadio II o III ⁴ , ya que las terapias son en gran medida ineficaces para erradicar la enfermedad metastásica en órganos distantes, Pulmón, hueso, bLluvia y / o hígado ⁵ . Esto es especialmente significativo dado que cuando la enfermedad metastásica se produce en ausencia de rebrote del tumor primario, esto implica que las células malignas diseminadas probablemente ya estaban presentes en los órganos secundarios en el momento de la cirugía definitiva. Por lo tanto, se necesitan urgentemente terapias capaces de erradicar o retardar el crecimiento de tumores metastásicos.

Mientras que los modelos de ratón de novo de la carcinogénesis mamaria han sido notablemente informativos en revelar mecanismos que regulan la progresión neoplásica ¹ , los modelos existentes también tienen varias limitaciones. Uno de ellos es el hecho de que los modelos transgénicos de novo típicamente desarrollan tumores primarios en múltiples glándulas mamarias, donde la carga tumoral primaria limita la duración de los estudios. Mientras que el escape de células tumorales primarias y la siembra metastásica probablemente ocurren temprano en la progresión neoplásica en estos modelos, el desarrollo franco de los tumores metastásicos ocurre tarde y dependiendoN el modelo del ratón y el fondo de la cepa, a menudo es parcialmente penetrante ¹ . Esto limita aún más la utilidad de los modelos de novo para el descubrimiento de moléculas que regulan la metástasis en los órganos secundarios y para evaluar la eficacia preclínica de los agentes terapéuticos en el contexto del adyuvante.

Para eludir estas limitaciones, se desarrolló un nuevo modelo autóctono de metástasis de carcinoma mamario a los pulmones. Las hembras transgénicas parentales ( es decir , MMTV-PyMT en el fondo de la cepa FVB / n para los estudios descritos en la presente memoria) que llevan tumores mamarios de novo de fase tardía se envejecen a ~ 100 días ⁶ , momento en el que sus tumores primarios son resecados quirúrgicamente y disociados enzimáticamente en Suspensiones de células individuales. Las suspensiones (1 x 10 ^ { ^6} células) a su vez se explantan ortotópicamente en ratones hembra singénicos receptores de 6-7 semanas de edad, en los que se desarrollan tumores mamarios primarios únicos durante un periodo de 38 a 60 días <stronG class = "xfig"> Figura 1A). En un tamaño de tumor definida (172 450 mm ^3), los ratones receptores son anestesiados y los tumores primarios se quirúrgicamente resecados de tal manera que el nuevo crecimiento del tumor en el sitio quirúrgico se reduce al mínimo, en consonancia con la cirugía en mujeres (Figura 1). En el fondo de la cepa FVB / n, los ratones desarrollan focos metastásicos detectables histológicamente en los pulmones con una penetración del 45% por ~ 115 días después de la cirugía ( Figura 1B ). Con esta latencia extendida de crecimiento tumoral metastático, el modelo está posicionado de forma única para la administración de terapia adyuvante y para elucidar y evaluar la biología subyacente que influye en la progresión metastásica después de la extirpación quirúrgica de tumores primarios.

Protocol

Los animales utilizados en el siguiente protocolo están cubiertos por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Salud y Ciencia de Oregon, diseñado para cumplir con las regulaciones de la Ley de Bienestar Animal y la Política del Servicio de Salud Pública (PHS). Mantenimiento de las condiciones estériles: Se deben usar instrumentos esterilizados y entre ratones, deben limpiarse con gasa estéril, enjuagarse con PBS y esterilizar con etanol al 70%…

Representative Results

Mayor que 75% de los ratones receptores recibieron 1 x 10 6 células de tumores mamarios primarios derivados de ratones MMTV-PYMT, desarrollar adenocarcinomas mamarios individuales varían en tamaño de 172 450 mm 3 dentro de 38-60 días (datos no mostrados). Ratones elegibles para la asignación al azar se inscribieron en grupos de estudio después de la resección quirúrgica de los tumores primarios, como se muestra ( Figura 1C ]. Re…

Discussion

Modificaciones y solución de problemas:

Cuando el tumor de disección romo se aleja de la pared abdominal, el tumor puede permanecer adherente a la pared abdominal. Esto se observó en <5% de ratones inyectados con tumor (datos no mostrados). Para ratones con tumores adherentes a la pared abdominal, el ratón debe ser sacrificado ya que la resección es difícil sin rebrote de tumor primario.

Limitaciones del modelo / técnica:</stron…

Materials

Isofluorane	Piramal Healthcare	N/A	Prescription order
Collagenase A	Roche	11088793001
DNase I	Roche	10104159001
DMEM	ThermoFisher	12634010
25 mL Pyrex bottle	Sigma-Aldrich	CLS139525
Fetal Bovine Serum	Atlanta Bio	S11150
0.7 µm nylon strainer	Corning	352350
50 mL conical tube	VWR	89039-658
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
Growth factor-reduced Matrigel	BD	354230	Growth factor-reduced solubilized basement membrane preparation extracted from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma
Poly(vinylpyrrolidone)–Iodine complex	Sigma-Aldrich	PVP1
29 gauge 0.3 mL insulin syringe	BD	324702
Small Vessel Cauterizer Kit	FST	18000-00
Wound clips	Texas Scientific	205016
AutoClip wound clip applier	BD	427630
AutoClip wound clip remover	BD	427637
Bromodeoxyuridine	Roche	10280879
Heparinized capillary tubes	Fisher	22362566
Microtainer tubes with dipotassium EDTA	BD	365974
20 mL syringe	BD	309661
DPBS	Thermo-Fisher	14190-250
OCT-freezing medium	VWR	25608930
Formalin, Buffered, 10% (Phosphate Buffer)	Fisher	SF100-4
23g needle	Fisher	14-826-6B
FVB/n mouse	Jackson Laboratories	001800